基于蛋白質組學探究西蘭花抗氧化系統對高氧脅迫的響應機制

張玉笑，陳 穎，郭衍銀，馬陽歷，楊 梅，付瑞青，孫玉芃

（山東理工大學農業工程與食品科學學院，山東 淄博 255049）

西蘭花含有豐富的抗氧化物質，如硫代葡萄糖苷（glucosinolate，GLS）、抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）等[1]。GLS是目前發現抗癌能力最強的異硫氰酸酯類[2]。AsA、GSH形成的AsA-GSH循環在機體抵御外界脅迫、平衡氧化還原環境、延緩衰老等方面均發揮重要作用[3]。同時，西蘭花中還含有大量的酚類物質、類黃酮和花色苷等，對于清除機體自由基、抑制細胞癌變和腫瘤發生均具有重要作用[1]。

西蘭花采后極易衰老，常溫下貯藏2～3 d便會因嚴重黃化而喪失商品價值。研究表明，西蘭花黃化衰老與抗氧化物質代謝有直接關系[4]。因此，維持抗氧化系統的穩定對延緩西蘭花采后衰老至關重要[5]。但西蘭花保鮮研究大多局限于個別抗氧化酶及抗氧化物質的分析，很少通過蛋白質組學技術整體分析西蘭花抗氧化系統應對逆境的響應機制。

目前，針對CO2處理的保鮮研究較為廣泛[6]，而關于高氧脅迫與抗氧化代謝之間的關系少有研究。前期研究發現，40% O2處理加速了西蘭花黃化衰老[6]，但具體機制需要進一步研究。

蛋白質組學是一種在分子水平上檢測生物體全部蛋白質結構、功能和含量的高效分析技術，已成功應用于多種果蔬貯藏期間品質變化機制的研究。本實驗以西蘭花為材料，通過同位素相對與絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）蛋白質組學技術結合相應生理生化指標，系統揭示高氧脅迫下西蘭花抗氧化物質和抗氧化酶在蛋白水平上的代謝變化及其響應機制，為高氧脅迫調控措施的制定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘優秀’（Brassica oleraceaL. var.italica）西蘭花采自山東省濰坊市劉家茅坨村，選取花球直徑12～14 cm、色澤一致、無機械傷和病蟲害的西蘭花作為實驗樣品。

8-plex試劑盒 美國Applied Biosystems公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、二甲基亞砜、三氯乙酸、三羥甲基氨基甲烷、尿素、碘乙酰胺 美國Sigma公司；胰蛋白酶（2 500 U/mg） 上海普洛麥格生物產品有限公司；乙腈 美國Thermo Fisher公司；還原型GSH試劑盒、偏磷酸、醋酸、2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）、2,6-二氯酚靛酚、福林-酚 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1750型紫外-可見分光光度計 日本島津有限公司；FA1204B型分析天平 上海賽多利斯科學儀器有限公司；5810/5810R冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DDS-307A電導率儀 上海精密科學儀器有限公司；DW-HL218超低溫冰箱 合肥中科美菱低溫科技有限公司；CR-400全自動測色色差計 日本Konica Minolta公司；1260半制備型液相色譜儀 美國Agilent公司；Triple TOF 5600 plus串聯四極桿飛行時間液相色譜-質譜聯用儀 美國Sciex公司；Nano LC-Ultra 1Dplus液相色譜儀 美國Eksigent公司；氣調箱（80 cm×40 cm×30 cm） 山東大有泡塑股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 采后西蘭花預處理

采收后的西蘭花在4 ℃下預冷3 h后隨機分成3 個處理組，每組24 個。將3 組西蘭花分別置于氣調箱內，并轉移到（20.0±0.5）℃的冷庫內，分別持續充入5%（體積分數，下同）O2＋5% CO2、20% O2＋5% CO2和40% O2＋5% CO2的混合氣體，以N2為平衡氣體。貯藏期間每天取樣，進行相關指標測定，并將0 d和4 d時的西蘭花樣品用液氮冷凍后存放在-80 ℃冰箱內，用于蛋白質組學分析。

1.3.2 生理指標測定

1.3.2.1 色度測定

色度值（a*、b*和H值）使用CR-400全自動測色色差計測定，每組選取3 個西蘭花，在花球邊緣位置選取5 個等距位置進行測定，記錄a*和b*值。當a*＞0且b*＞0時，H值計算如公式（1）所示；當a*＜0且b*＞0時，H值計算如公式（2）所示。

1.3.2.2 AsA含量測定

AsA含量采用DNPH比色法[6]測定。結果以鮮樣品質量計，單位為g/kg。

1.3.2.3 GSH含量測定

GSH含量通過還原型GSH試劑盒測定。取1 g西蘭花樣品，加入5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）研磨成漿，隨后在4 ℃、10 000 r/min條件下離心15 min，取上清液后按照還原型GSH試劑盒說明書測定GSH含量。

1.3.2.4 GLS含量測定

GLS含量測定參考Miao Huiying等[2]的方法并略作修改。取0.5 g西蘭花樣品，用5 mL體積分數90%甲醇溶液提取后，室溫靜置1 h。隨后在12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液用于GLS含量測定。采用苯酚硫酸法測定葡萄糖含量，并通過葡萄糖含量計算樣品中GLS含量，單位為mmol/kg。

1.3.2.5 多酚和類黃酮含量測定

多酚含量采用福林-酚法[7]測定；類黃酮含量參照Li Shiping等[8]方法測定。

1.3.3 蛋白質組學分析

1.3.3.1 蛋白質提取

將西蘭花樣品冷凍干燥后，取3 g樣品加入5 mL裂解緩沖液（pH 7.6，內含1 mmol DTT和質量濃度0.04 mg/mL SDS）裂解蛋白，120 W超聲處理15 min后，15 000 r/min離心20 min。向上清液中加入5 倍體積的10%（體積分數，下同）三氯乙酸溶液，再次離心后收集沉淀。使用預冷丙酮洗滌兩次沉淀后，向蛋白質沉淀中加入0.5 mL Tris-HCl緩沖液（pH 8.0，內含8 mol/L尿素），振蕩至完全溶解。再加入0.2 mL DTT溶液（內含50 mmol/L DTT和8 mol/L尿素），37 ℃水浴1 h。隨后加入0.1 mL 50 mmol/L碘乙酰胺溶液，靜置1 h后15 000 r/min離心20 min，上清液即為蛋白提取液。按照Bradford[9]的方法測定蛋白質量濃度。

1.3.3.2 iTRAQ標記和多肽分離

在蛋白溶液中按照蛋白質與酶質量比30∶1加入胰蛋白酶，37 ℃酶解4 h，立即加入2 μL 0.2%三氟乙酸來終止酶解。通過固相萃取柱Sep-Pak C18進行脫鹽后，將多肽經離心濃縮儀脫水干燥。通過8-plex試劑盒對酶解后的肽段進行iTRAQ標記。標記后的多肽使用1260半制備型高效液相色譜儀進行分離，最終合并成20 個組分。色譜柱為Tech Mate C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相A為20 mmol/L甲氨酸溶液（氨水調pH值至10），流動相B為20 mmol/L甲氨酸-乙腈溶液；進樣量為100 μL；流速為0.2 mL/min；柱溫為25 ℃；運行時間為60 min；檢測波長為216 nm。

1.3.3.3 液相色譜-串聯質譜分析

通過四極桿飛行時間液相色譜-串聯質譜聯用儀對樣品進行液相色譜-二級質譜分析。色譜柱為Eksigent C18（75 μm×150 mm，3 μm）。流動相A為含0.1%（體積分數）甲酸和3%（體積分數）二甲基亞砜的水溶液，流動相B為含0.1%甲酸和3%二甲基亞砜的乙腈溶液。洗脫梯度為0 min，5% B；0～65 min，5%～23% B；65～85 min，23%～52% B；85～86 min，52%～80% B；86～90 min，80% B；90～90.1 min，80%～5% B；90.1～100 min，5% B，流速為300 nL/min。

按照質譜數據依賴型掃描模式掃描，每個掃描循環中包含1 個MS全掃描（質量掃描范圍為m/z350～1 500，離子累積時間為250 ms）和40 個MS/MS掃描（質量掃描范圍為m/z100～1 500，離子累積時間為50 ms）。

1.3.3.4 生物信息學分析

差異表達蛋白的篩選以表達差異倍數≥1.20或≤0.83為標準。鑒定后的差異表達蛋白通過Genome蛋白數據庫（http://www.rosaceae.org/node/355）進行基因本體論（gene ontology，GO）注釋。通過同源蛋白簇（clusters of orthologous groups，COG）數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數據庫（http://www.genome.jp/kegg/）對差異表達蛋白進行注釋和分類。

1.4 數據處理與分析

生理指標或蛋白質組學分析中所有樣品的測定均重復3 次，實驗結果以平均值±標準差表示。數據統計分析采用SPSS Statistics 26軟件，通過單因素方差分析進行Duncan多重檢驗（以P＜0.05表示差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 高氧脅迫對西蘭花的生理指標的影響

2.1.1 高氧脅迫對西蘭花色度的影響

黃化是西蘭花品質劣變的重要表觀評價指標，而色度值能直接反映出西蘭花的顏色變化。b*值代表黃藍度，其越高顏色越黃。H值代表色相，其與成熟度成反比。如圖1A、B所示，西蘭花的b*值和H值在整體上分別呈上升和先上升后下降的趨勢，且40% O2＋5% CO2處理維持了更高的b*值和更低的H值。貯藏4 d時，40% O2＋5% CO2處理西蘭花的b*值比5% O2＋5% CO2和20% O2＋5% CO2處理分別增加70.86%和15.14%，這說明高氧脅迫顯著加劇了西蘭花黃化。

圖1 不同氧氣體積分數對西蘭花b*值（A）和H值（B）的影響Fig. 1 Effects of different O2 concentrations on b* (A) and H (B) values of broccoli heads

2.1.2 高氧脅迫對西蘭花抗氧化物質含量的影響

西蘭花抗氧化物質的降解，既反映了自身自由基清除能力的降低，又反映了其營養品質的損失。貯藏期間，西蘭花GLS、AsA含量和GSH含量均呈下降趨勢，且40% O2＋5% CO2處理組的GLS、AsA含量和GSH含量明顯低于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組（圖2A～C）。40% O2＋5% CO2處理組西蘭花GLS、AsA和GSH含量在4 d時僅分別為5% O2＋5% CO2處理組的62.20%、60.32%和79.91%，這表明高氧脅迫嚴重加劇了西蘭花抗氧化物質的降解，并降低了西蘭花對脅迫的抵御能力。

圖2 不同氧氣體積分數對西蘭花GLS（A）、AsA（B）、GSH（C）、多酚（D）和類黃酮（E）含量的影響Fig. 2 Effects of different O2 concentrations on the contents of GLS (A),AsA (B), GSH (C), polyphenols (D) and flavonoids (E) in broccoli heads

各組西蘭花的多酚含量和類黃酮含量均呈先升高后降低的趨勢（圖2D、E）。在貯藏1 d時，40% O2＋5% CO2處理的西蘭花多酚含量和類黃酮含量顯著高于低O2處理組（P＜0.05），2 d后迅速降低，貯藏結束時則顯著低于5% O2＋5% CO2處理組（P＜0.05），這可能與高氧脅迫在貯藏前期激活了西蘭花中多酚和類黃酮的生物合成途徑有關。

綜上所述，高氧脅迫加速了西蘭花的黃化和抗氧化物質的整體降解，嚴重降低了西蘭花的抗氧化能力。另外研究發現，在貯藏4 d時西蘭花的色度值與抗氧化物質含量均發生了較為明顯的變化，尤其是40% O2＋5% CO2處理組。因此，選擇貯藏0 d與4 d時各處理的西蘭花樣品進行蛋白質組學分析，進一步探究高氧脅迫下西蘭花抗氧化系統變化及其響應機制。

2.2 蛋白質組學分析結果

通過西蘭花iTRAQ蛋白質組學分析共鑒定了7 000 個可信蛋白質（至少含有一個特異性肽段，且在99%置信區間上的蛋白評分≥20），以貯藏0 d時的西蘭花為相對定量參照標準，對貯藏4 d后各組西蘭花中的蛋白質以表達差異倍數≥1.2（或≤0.83）為標準篩選（P＜0.05），共獲得1 523 個差異表達蛋白。為了有針對性分析高氧脅迫下西蘭花抗氧化系統變化，通過已有文獻結果結合KEGG通路分析，對與抗氧化系統相關的差異表達蛋白進行進一步篩選，共篩選出76 個差異表達蛋白，涉及到AsA-GSH循環、GLS、多酚及類黃酮、抗氧化酶代謝、其他抗氧化物質（包括葉酸、核黃素、類胡蘿卜素等）等通路（表1）。

表1 不同處理組間抗氧化系統中差異表達蛋白的詳細信息Table 1 Detailed information of differentially expressed proteins related to antioxidant system between different treatments

續表1

如圖3A所示，各比較組中上調差異表達蛋白數量遠多于下調差異表達蛋白數量，且40% O2＋5% CO2處理4 d/0 d的差異表達蛋白數量遠多于其他兩個處理組，表明在高氧脅迫下西蘭花內更多差異表達蛋白的表達被激活。維恩圖分析結果表明，31 個蛋白僅在40% O2＋5% CO2處理組中存在差異表達，而在5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組中未出現差異表達（圖3B），這說明高氧處理可能通過調控這些抗氧化蛋白的表達，進而加速西蘭花黃化衰老。

圖3 差異表達蛋白質上調/下調情況（A）與維恩圖（B）Fig. 3 Numbers of up-regulated and down-regulated differentially expressed proteins (A) and Veen plot (B)

2.3 生物信息學分析

2.3.1 GO注釋分析

為了進一步了解西蘭花在高氧脅迫下差異表達蛋白的生物學功能，對差異表達蛋白進行了GO注釋分析，從分子功能、細胞成分和生物學過程方面進行富集分析，結果如圖4所示。在分子功能方面，不同O2處理下的西蘭花差異表達蛋白主要體現在催化活性、結合以及抗氧化活性等；細胞成分方面主要定位在細胞、細胞組分、細胞器和膜等；參與調控的生物學過程主要包括代謝過程、細胞過程以及應激反應等。另外，在幾乎所有GO分析類別中，40% O2＋5% CO2處理下西蘭花的差異表達蛋白數量都遠多于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組，這也證明高氧脅迫對這些抗氧化系統相關蛋白的調控很可能與西蘭花黃化與衰老有關。各類別中，5% O2＋5% CO2處理組的差異表達蛋白同樣略少于20% O2＋5% CO2處理組，表明西蘭花貯藏期間的抗氧化系統差異表達蛋白的表達水平隨著O2體積分數的增加而增加。

圖4 西蘭花響應O2脅迫差異表達蛋白GO分析Fig. 4 GO analysis of differentially expressed proteins of broccoli in response to O2 stress

2.3.2 COG分析

COG富集分析結果表明，西蘭花響應O2脅迫的差異表達蛋白涉及了15 類COG功能（圖5）。其主要參與了碳水化合物轉運和代謝、次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝、翻譯后修飾、蛋白轉換和分子伴侶、一般功能預測和無機離子轉運與代謝。在這些COG功能類別中，40% O2＋5% CO2處理組的西蘭花差異表達蛋白數量遠超過低O2處理組，這說明西蘭花響應高氧脅迫下抗氧化代謝的差異表達蛋白參與了更多的生理代謝途徑，同時也證明這些主要的功能途徑與西蘭花抗氧化系統的調控具有互作關系。

圖5 西蘭花響應O2脅迫差異表達蛋白的COG分析Fig. 5 COG analysis of differentially expressed proteins of broccoli in response to O2 stress

3 討 論

有研究發現，高氧脅迫可影響西蘭花抗氧化酶、抗氧化物質代謝等相關生物學過程[6,10-11]。本研究通過生理生化指標分析結合iTRAQ蛋白質組學，綜合分析了高氧脅迫下西蘭花抗氧化物質含量并量化了響應高氧脅迫的蛋白質，通過KEGG通路分析篩選出76 個與抗氧化代謝相關的差異表達蛋白。在KEGG通路分析的基礎上，進一步分析與AsA-GSH循環、GLS代謝、多酚和類黃酮代謝、抗氧化酶代謝及其他抗氧化物質代謝等代謝通路相關的差異表達蛋白（表1），旨在揭示高氧脅迫破壞西蘭花抗氧化系統機理，為進一步研究高O2脅迫的調控措施提供理論依據。

3.1 與AsA-GSH循環相關的差異表達蛋白

AsA-GSH循環是植物體清除自由基、緩解氧化損傷的重要代謝途徑[12]。GR、MDAR、APX和GPX是維持AsA-GSH循環的主要酶[13]。APX和GPX不僅是植物體內重要的抗氧化酶，同時在AsA-GSH循環中重新合成脫氫抗壞血酸和氧化型GSH起到不可替代的作用[14]。蛋白質組學數據分析結果表明，相比于5% O2＋5% CO2處理組和20% O2＋5% CO2處理組，40% O2＋5% CO2處理組上調了GR和MDAR的表達，同時下調了APX和GPX的表達，表明脫氫抗壞血酸和氧化型GSH的合成能力降低，進而影響到AsA-GSH循環的順利進行（表1）。GGT、OXP會導致植物體GSH降解，40% O2＋5% CO2處理同時上調了GGT和OXP的表達，表明高氧脅迫促進了西蘭花GSH的降解，這與圖2C中GSH含量降低的結果相印證。因此，高氧脅迫下APX和GPX下調與GGT和OXP上調影響了西蘭花的AsA-GSH循環，進而加速了西蘭花抗氧化能力的下降。有研究發現，外源AsA和GSH處理能改善西蘭花的抗氧化能力，并延緩西蘭花的黃化衰老[15-16]，因此外源添加AsA和GSH可以作為緩解高O2脅迫破壞西蘭花AsAGSH循環的有效措施。

3.2 與GLS代謝相關的差異表達蛋白

在西蘭花中含有極其豐富的GLS，尤其是蘿卜硫素，是西蘭花重要的抗氧化物質。MYS是已發現的一類最重要的GLS降解酶，在GLS降解中發揮著不可替代的作用[17]。高氧脅迫下，本研究共鑒定出16 種差異表達MYS，且40% O2＋5% CO2處理組中16 種MYS的表達均被上調，進而促進了西蘭花GLS降解，圖2A的結果也證實了這一點，而MYS表達上調可能是促進西蘭花黃化衰老的重要原因。

3.3 多酚和類黃酮代謝相關的差異表達蛋白

莽草酸途徑及苯丙烷類代謝途徑是調節植物體碳流量的重要途徑，也是多酚、類黃酮、類胡蘿卜素、葉酸等次級代謝產物合成的關鍵途徑[18]。4CL、CCR和CAD是多酚和木質素合成的關鍵酶，而C4H和CHS是類黃酮合成的限速酶[19-20]。在40% O2＋5% CO2處理組中，以上蛋白質的表達幾乎均被上調，這可能是貯藏初期40%O2＋5% CO2處理組的多酚和類黃酮含量高于其他處理組的原因（圖2D、E）。

SDH是莽草酸途徑唯一的雙功能酶，負責催化莽草酸和沒食子酸合成；而FLS是黃酮醇合成的關鍵酶[21-22]。蛋白組學結果表明，40% O2＋5% CO2處理組與5% O2＋5% CO2處理組SDH和FLS的表達差異倍數分別是0.77 倍和0.83 倍，表明高氧脅迫下調了西蘭花的莽草酸合成。莽草酸是多酚和類黃酮合成的關鍵前體物質，莽草酸和黃酮醇合成減少可能是高氧脅迫下西蘭花貯藏后期多酚和類黃酮含量過低的主要原因（圖2D、E）。

3.4 與抗氧化酶代謝相關的差異表達蛋白

SOD、CAT、TrxR、APX和GPX等是植物體內重要的抗氧化酶，負責體內超氧陰離子、自由基、H2O2等活性氧的清除，以保護細胞器不受氧化損傷。蛋白質組學結果顯示，相比于5% O2＋5% CO2處理組，40% O2＋5% CO2處理組SOD、TrxR、APX和GPX表達下調，同時上調了CAT的表達，這說明高氧脅迫在整體上削弱了西蘭花體內的抗氧化酶系統。前期研究發現，適宜濃度的高H2O2反而可以通過下調葉綠素降解酶的基因表達而延緩西蘭花黃化[6,23]。因此，SOD活力降低以及CAT活力增加減少了西蘭花H2O2的積累，反而可能是造成西蘭花黃化和品質降低的一個重要原因[24-25]。

3.5 與其他抗氧化物質代謝相關的差異表達蛋白

類胡蘿卜素是西蘭花內主要的抗氧化物質，在葉綠體中起到保護葉綠素不被降解的作用，但同時也是一類導致西蘭花黃化的主要呈色色素[26]。PIM、LUT5和玉米黃質環氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）參與了類胡蘿卜素合成途徑的調控[27-28]。蛋白質組學分析結果表明，40% O2＋5% CO2處理明顯提高了PIM、LUT5和ZEP的表達水平，從而促進了類胡蘿卜素合成，這可能是高氧脅迫下加速西蘭花黃化的原因之一。HID是異黃酮合成的關鍵酶，異黃酮是重要的黃色呈色物質[29]。40% O2＋5% CO2處理增加了HID的表達，這可能是高氧脅迫促進西蘭花黃化的另一原因。

4 結 論

本研究通過生理生化指標結合iTRAQ蛋白質組學技術，研究了高氧脅迫下西蘭花貯藏期間的蛋白質表達變化情況，在蛋白質水平上探討了西蘭花的抗氧化響應機制。結果表明，不同O2水平下共有76 個與抗氧化代謝相關的蛋白質出現差異表達。高氧脅迫通過下調西蘭花APX、GPX、GGT和OXP表達抑制了AsA-GSH循環，通過下調16 種MYS表達促進GLS降解，通過抑制SOD、TrxR、APX和GPX等抗氧化酶活力降低西蘭花的抗氧化能力和貯藏品質，通過上調類胡蘿卜素及異黃酮的合成促進西蘭花黃化。本研究綜合分析了高氧脅迫下西蘭花抗氧化代謝系統的變化情況和應對機制，可為高氧脅迫緩解措施的制定提供理論依據。