黑參發酵對疲勞應激誘導氧化損傷的防護作用及與白參、紅參和人參漿果的比較

李秋陽，唐金鑫，劉士偉，徐 萍，鄒佳琪，陰 裴，米倩雯，于 雷，王麗娜，畢云楓,*

（1.吉林農業大學食品科學與工程學院，吉林 長春 130118；2.吉林醫藥學院藥學院，吉林 吉林 132013）

身體疲勞是一個復雜的生理過程，可以定義為依賴于劇烈運動和較大壓力引起的難以維持規律的非自愿活動[1]。目前有幾種理論可以解釋運動后身體疲勞的潛在機制：1）乳酸和尿素氮等代謝物的過度產生和積累導致肌肉疲勞[2]；2）肌肉或其他相關器官（如肝臟）中活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產生引起的氧化應激損傷[3]。

近年來，研究人員廣泛研究了中草藥和營養食品在對抗身體疲勞方面的有益作用。已有研究發現天然產物可通過抑制代謝物產生、緩解氧化應激或改善糖原代謝來延緩疲勞并提高運動表現[4-5]。人參具有多種生物活性和藥理作用，如抗腫瘤、抗疲勞[6]、抗氧化、提高機體免疫力及降糖降脂等作用[7-9]。人參炮制品主要有白參、紅參和黑參[10]。與白參和紅參相比，黑參具有更強的抗炎、抗腫瘤、提高免疫力等生物活性[11]。人參漿果即人參鮮果實，也具有改善與治療心律失常和抗疲勞的功效[12]。有研究表明人參發酵后可生成多種生物活性物質，如稀有人參皂苷、多酚和氨基酸，使人參的藥理功效顯著提升[13]，但將發酵前后白參、紅參、黑參、人參漿果的抗疲勞活性與氧化應激相關性進行對比的研究還鮮見報道。

本研究旨在對比探究同一給藥劑量下白參、紅參、黑參及人參漿果發酵前后對于劇烈運動小鼠疲勞緩解及氧化損傷的保護作用。在小鼠游泳訓練后，測定血清尿素氮、乳酸濃度及肌肉乳酸濃度；對小鼠肌肉和肝臟中糖原水平的變化進行檢測。同時測定肌肉和肝臟中與疲勞相關的代謝物和氧化還原狀態參數，為幾種原料參的利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、菌株、材料與試劑

120 只雄性ICR小鼠（3～4 周齡、體質量為18～22 g）購于遼寧長生生物技術股份有限公司，生產許可證號：SCXK（遼）2020-0001；實驗動物使用許可證號：SYXK（吉）2018-0023。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）由課題組從市售泡菜中分離，現保藏于吉林農業大學新資源食品開發與利用團隊實驗室；腸膜明串珠菌腸膜亞種（Leuconostoc mesenteroidessubsp.mesenteroides）（CICC 22184）購于中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）。

白參、紅參、黑參、人參漿果（經吉林農業大學中藥材學院何忠梅教授鑒定） 通化市人參交易市場；稀有人參皂苷（Rh1、Rg2、F1、Rk3、F2、Rh4、Rg3、PPT苷元、CK、Rk1、Rg5、Rh2、PPD苷元）標準品 金盛生物科技有限公司；乳酸試劑盒、尿素氮試劑盒、糖原試劑盒、蛋白含量定量試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；紅景天膠囊 四川寶興制藥有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技有限公司；UV-2600I型可見分光光度計 島津企業管理（中國）有限公司；BSA224S型天平 北京賽多利斯科學儀器有限公司；HC-3018型臺式高速冷凍離心機安徽中科中佳科學儀器有限公司；Multiskan FC型酶標儀賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Sinocare安穩血糖測定儀 三諾生物傳感股份有限公司；HN-2型水浴鍋上海利辰邦儀器科技有限公司；BXM-30R型滅菌鍋上海東亞壓力容器制造有限公司；HPX-9082型數顯電熱培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 人參發酵前后樣品的制備

分別將植物乳桿菌、腸膜明串珠菌腸膜亞種按照接種量5%（體積分數，下同）加入新鮮De Man Rogosa Sharpe（MRS）培養基中，37 ℃培養24 h進行活化，然后兩種菌均按照接種量5%混合接種至新鮮MRS培養基中37 ℃培養24 h備用，混合菌液中的活菌數為3.63×108CFU/mL。將白參、紅參、黑參干制品粉碎，然后分別過60 目篩，將鮮人參漿果碾碎。分別取60 g人參干制品粉末和碾碎的人參漿果，加入120 mL去離子水和9.0 mL生理鹽水中，混勻后即獲得發酵前樣品，現用現制。分別取60 g人參干制品粉末和碾碎的人參漿果，加入120 mL去離子水，接種9.0 mL植物乳桿菌-腸膜明串珠菌腸膜亞種混合菌液，室溫發酵23 d后備用。鮮人參漿果于-20 ℃凍存，人參干制品于室溫下貯藏。

1.3.2 總稀有人參皂苷含量的測定

1.3.2.1 人參皂苷的提取

準確稱取適量1.3.1節發酵前后樣品于燒杯中，按照料液比1∶3（m/V）加入無水甲醇溶液超聲30 min，靜置12 h后離心（3 500 r/min、10 min），收集上清液，在沉淀物中按照料液比1∶3（m/V）加入無水甲醇繼續超聲30 min，靜置12 h后離心（3 000 r/min、10 min），收集并合并兩次超聲提前后的上清液，80 ℃水浴蒸發至原體積的1/2，隨后加入4 倍體積的正丁醇溶液，搖勻，靜置12 h后離心（3 000 r/min、10 min），將上清液50 ℃旋轉蒸發至近干，加入色譜純甲醇溶解后過0.22 μm濾膜，即得人參皂苷提取液。

1.3.2.2 高效液相色譜法測定人參皂苷含量

色譜柱為C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相A為乙腈，流動相B為0.05 mol/L磷酸鹽水溶液；梯度洗脫（0.1 min，18% A；0.1～5 min，18% A；5～20 min，21% A；20～22 min，21%～26% A；22～26 min，26%～32% A；26～46 min，32%～33.8% A；46～51 min，33.8%～38% A；51～57.7 min，38%～49% A；57.7～58 min，49%～49.1% A；58～62 min，49.1% A；62～63 min，49.1%～50.6% A；63～68 min，50.6%～59.6% A；68～69.8 min，59.6%～65% A；69.8～72 min，65% A；72～77 min，65% A；77～94 min，65%～85% A；94～97 min，18% A；97～120 min，18% A）。檢測波長203 nm，流速1.0 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃。采用外標法進行定量。

1.3.3 動物飼養及分組

ICR小鼠飼養于吉林農業大學動物實驗中心，環境條件保持在室溫（25±2）℃、相對濕度（60±5）%、12 h光照/黑暗循環，以小鼠標準飼料常規飼養，自由進食和飲水。經過1 周的適應喂養后，將小鼠隨機分為10 組，每組12 只，10 個實驗組分別為：空白對照組（生理鹽水）、陽性對照組（紅景天膠囊粉末）[14]、白參發酵前/后組、紅參發酵前/后組、黑參發酵前/后組、人參漿果發酵前/后組。根據《中華人民共和國藥典》（2015版）中成人人參每日攝入量，換算得小鼠的人參發酵物給藥劑量為0.3～0.9 g/（kgmb·d）。參照屈青松等[13]的報道確定人參發酵物最佳給藥劑量。各組小鼠分別灌胃0.5 g/（kgmb·d）不同干預物（以紅景天膠囊粉末、人參干制品和人參漿果質量計），連續給藥30 d。具體給藥方式為將0.5 g各組干預物與2 mL生理鹽水混勻后進行灌胃。

1.3.4 健康指標測定

實驗開始后，稱量并記錄小鼠的初始體質量、最終體質量、體質量增加量，同時稱量飼料質量，計算每日攝食量（消耗飼料質量/30，單位為g/d）[15]。

1.3.5 運動能力測定

每組隨機選取6 只小鼠進行力竭游泳實驗。小鼠連續灌胃給藥30 d，末次給藥30 min后，將1/10小鼠體質量的鉛皮捆綁在尾部，并置于水深超過30 cm、水溫恒溫在（28.0±0.5）℃的游泳池中，小鼠沉入池底10 s無反應視為死亡，記錄從游泳開始至死亡的時間，即為小鼠的游泳力竭時間/min，按下式計算游泳力竭時間延長率。負重游泳期間若有小鼠躬腰停止、懸浮休息，用玻璃棒攪動附近水流迫使其不停運動。

1.3.6 代謝物積累指標、能量儲備指標及氧化應激指標測定

小鼠連續灌胃給藥30 d，末次給藥30 min后每組隨機選取6 只小鼠在游泳池中運動30 min，休息20 min后摘除眼球采血約1 mL，將所得血樣3 000 r/min離心20 min，分離血清[16]，參考尿素氮和乳酸試劑盒說明書測定血清尿素氮和乳酸濃度（代謝物累積指標）。隨后立即處死小鼠，稱取0.1 g小鼠后腿肌肉，按照試劑盒說明書測定肌肉乳酸濃度（代謝物累積指標）。稱取0.085 g小鼠后腿肌肉、0.075 g肝臟組織，按照糖原試劑盒分別測定肌/肝糖原含量（能量儲備指標）。稱取0.1 g肝組織，參考相應試劑盒說明書測定肝組織中MDA含量以及T-SOD、GSH-Px活力（氧化應激指標）[17]。

1.4 數據處理與分析

數據表示為平均值±標準偏差，采用Excel 2019軟件、Originpro 8.5軟件作圖及SPSS 26軟件進行數據分析，采用t檢驗進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，采用Pearson相關性分析法進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同人參制品中的總稀有人參皂苷含量

采用高效液相色譜法測定不同人參制品中13 種稀有人參皂苷（Rh1、Rg2、F1、Rk3、F2、Rh4、Rg3、PPT苷元、CK、Rk1、Rg5、Rh2、PPD苷元）的含量。由表1可知，與白參相比，紅參和黑參中總稀有人參皂苷含量增加；各組人參在發酵后總稀有人參皂苷含量明顯增加，其中人參漿果發酵后總稀有人參皂苷含量最低（2.105 5 mg/g），黑參發酵后總稀有人參皂苷含量最高（9.487 mg/g）。

表1 不同人參制品發酵前后總稀有人參皂苷含量Table 1 Comparison of rare ginsenosides in native and fermented ginseng products

2.2 人參發酵前后樣品對小鼠體質量及攝食量的影響

小鼠體質量的變化直接反映小鼠的生長情況，體質量增長或下降過快都不利于小鼠的健康。如表2所示，干預30 d后，各組小鼠的體質量隨給藥時間的延長而增長，各組小鼠體質量增加量差異不明顯，且與空白對照組相比，陽性對照組與人參制品干預組并沒有差異。觀察小鼠狀態，并未出現小鼠死亡，行動遲緩，行為異樣等狀況，說明各組藥物不會促進或抑制小鼠生長，且無任何毒副作用，小鼠仍處于正常生長狀態。

表2 干預過程中小鼠體質量及攝食量的變化（n＝12）Table 2 Changes in body mass and food intake of mice during administration (n = 12)

2.3 人參發酵前后樣品對小鼠運動能力的影響

運動能力是直接體現小鼠疲勞狀態的方式之一。力竭游泳實驗可以較好地評估小鼠的疲勞狀態。小鼠游泳力竭時間越長，說明該藥物的作用效果越明顯。由表3可知，小鼠在給予同等藥物濃度下，相對于空白對照組，陽性對照組給藥小鼠游泳力竭時間極顯著延長（P＜0.01）。與陽性對照組相比，白參、紅參、黑參及人參漿果給藥組小鼠游泳力竭時間明顯延長，尤其各組人參發酵后，較陽性對照組顯著或極顯著延長游泳力竭時間（P＜0.05、P＜0.01） ，以發酵后黑參效果最佳（P＜0.01），游泳力竭時間延長率達到143.40%。以上結果表明不同人參制品及人參漿果發酵后比發酵前能明顯延長小鼠游泳力竭時間，具有良好的抗疲勞效果。

表3 藥物對小鼠運動能力的影響（n＝6）Table 3 Effects of drugs on exercise capacity of mice (n = 6)

2.4 人參發酵前后樣品對小鼠代謝物累積指標的影響

糖酵解是短時間內劇烈運動的主要能量來源，乳酸是碳水化合物在無氧狀態下的糖酵解產物[18]。因此，乳酸是運動強度或疲勞程度的重要參數之一。在進行長時間運動時，肌肉中氧氣消耗加快，機體開始進行無氧代謝，糖酵解進程加速，導致大量乳酸堆積，進而影響新陳代謝及機體各系統的功能，降低運動能力并產生疲勞感[19-20]。由圖1A、B可知，與空白對照組比較，陽性對照組血清乳酸及肌肉乳酸水平極顯著降低（P＜0.01）。與陽性對照組相比，不同人參制品干預的小鼠血清乳酸濃度呈不同程度的降低。與陽性對照組相比，在發酵前，人參漿果降低血清乳酸濃度能力稍弱，其他3 種人參制品多呈現基本相似的效果；在發酵后，黑參組降低血清乳酸濃度的效果極顯著提高（P＜0.01）。在降低肌肉乳酸含量方面，發酵前、后均呈人參漿果＜白參＜紅參＜黑參的趨勢，以發酵后的黑參效果最好，其對應的肌肉乳酸含量與陽性對照組相比下降了12.70%。以上結果表明，小鼠在給予同等劑量藥物條件下，人參發酵后對比發酵前表現出更好的緩解或清除小鼠血清及肌肉乳酸堆積，具有較好的抗疲勞效果。

長時間及高強度運動時，機體大量消耗糖原，且在沒有及時補充糖原情況下，機體就會消耗蛋白質用以供能，蛋白質代謝最終生成尿素[21-22]。由圖1C可以看出，與空白對照組相比，各組血清尿素氮濃度明顯降低。與陽性對照組相比，除黑參發酵前組外，各給藥組血清尿素氮濃度顯著降低（P＜0.05）；在發酵前，血清尿素氮濃度為黑參＜紅參＜人參漿果＜白參；發酵后，紅參及黑參組血清尿素氮濃度較陽性對照組極顯著降低（P＜0.01），以黑參降低效果最明顯，分別為空白對照組和陽性對照組的43.91%和31.99%。以上結果表明，小鼠在給予同等藥物濃度下，不同參類對降低小鼠血清尿素氮濃度效果不同，但是與發酵前黑參對比，發酵后黑參表現出較好的抗疲勞效果。

圖1 人參發酵前后樣品對小鼠代謝物累積指標的影響（n＝6）Fig. 1 Effect of native and fermented ginseng products on metabolite accumulation indexes in mice (n = 6)

2.5 人參發酵前后樣品對小鼠能量儲備指標的影響

研究表明，葡萄糖是組織糖原的分解產物，在劇烈運動后作為能量利用的循環底物被釋放，在運動期間，能量需求會加速肌肉葡萄糖的利用，從而增加血糖的消耗。在機體運動時，如果沒有及時補充糖原，機體很容易出現低血糖的癥狀從而引起機體疲勞[23]。由圖2A可以看出，與空白對照組相比，干預后小鼠血糖濃度出現不同程度的升高，表明運動后各組藥物干預可以維持血糖濃度，降低疲勞感。

肝臟和肌肉糖原是糖酵解和能量產生底物的來源，是抵御能量消耗的第一道防線[24]，因此，肝臟和肌肉中的糖原水平都是與疲勞程度密切相關的指標。在劇烈運動時，肝糖原可能分解為葡萄糖作為替代能源，然后血流將包括葡萄糖在內的營養物質輸送到支持運動的工作肌肉[25]。如圖2B、C所示，在運動后，與空白對照組比較，陽性對照組肌糖原和肝糖原含量極顯著增加（P＜0.01）。在發酵前，不同人參及人參漿果干預組小鼠的肝臟和肌肉中糖原含量呈人參漿果＜紅參＜白參＜黑參。與發酵前人參處理組相比，發酵后人參各處理組小鼠肝臟和肌肉中的糖原含量增加。黑參在發酵后糖原含量顯著高于陽性對照組（P＜0.05），肌糖原含量達空白對照組的2.11 倍，肝糖原含量達空白對照組的2.32 倍。這些結果表明，喂食黑參尤其是發酵后的黑參可使糖原累積物增加，從而增加小鼠耐力并延遲疲勞的發生。

圖2 人參發酵前后樣品對小鼠能量儲備指標的影響（n＝6）Fig. 2 Effect of native and fermented ginseng products on energy reserve indexes of mice (n = 6)

2.6 人參發酵前后樣品對小鼠氧化應激指標的影響

ROS在人體正常生理和病理過程中起著至關重要的作用[26]。劇烈運動使ROS含量急速增加，引起過度的氧化應激，并進一步導致不可逆的氧化損傷[27]。包括GSH-Px和T-SOD在內的細胞主要防御抗氧化酶可以防止生物大分子物質如DNA、蛋白質和脂質免受ROS的攻擊。MDA是脂質過氧化的終產物，也是氧化應激的重要生物標志物[28]。因此，提升T-SOD和GSH-Px活力，降低MDA含量，可以有效減輕氧化應激造成的機體損傷，緩解或者消除疲勞。由圖3A可知，對比于空白對照組，陽性對照組可極顯著降低肝臟內MDA含量（P＜0.01）。相比陽性對照組，發酵后的人參干制品組MDA含量極顯著降低（P＜0.01）。在發酵前，白參組小鼠表現出較低的MDA含量。發酵后，相對于其他組，喂食發酵后黑參的小鼠MDA含量最低，是陽性對照組的56.05%。

與空白對照組相比，陽性對照組中小鼠肝臟GSH-Px活力顯著增加（P＜0.05），而與陽性對照組相比，喂食人參后，各組GSH-Px活力明顯提升，且在發酵前白參、紅參、黑參組小鼠機體GSH-Px活力分別為陽性對照組的1.596、1.560 倍及1.593 倍。在發酵后，與陽性對照組相比，人參漿果組GSH-Px活力極顯著提升（P＜0.01），黑參GSH-Px活力也極顯著提升（P＜0.01），分別是空白對照組和陽性對照組的2.08 倍和1.75 倍。

由圖3C可知，陽性對照組可極顯著提高小鼠肝臟中T-SOD活力，為空白對照組的1.9 倍。各人參處理組T-SOD活力雖不及陽性對照組，但較空白對照組明顯提高。發酵前紅參和黑參組的T-SOD活力相近，白參和人參漿果組T-SOD活力較低，但均高于空白對照組；發酵后黑參組T-SOD活力與陽性對照組差異不顯著（P＞0.05），說明發酵后黑參也具有較好的抗氧化效果。

圖3 人參發酵前后樣品對小鼠氧化應激指標的影響（n＝6）Fig. 3 Effect of native and fermented ginseng products on oxidative stress indexes in mice (n = 6)

2.7 抗疲勞指標、氧化應激指標相關性分析結果

氧化應激指標、抗疲勞指標之間的Pearson相關性分析結果如圖4所示，小鼠組織中的T-SOD活力和GSH-Px活力與小鼠機體中的肝糖原、肌糖原含量呈正相關，與血清尿素氮、血清乳酸、肌肉乳酸水平呈負相關。而MDA含量與小鼠機體中的肝糖原、肌糖原含量呈負相關，與血清尿素氮、血清乳酸、肌肉乳酸濃度呈正相關。這說明小鼠體內的氧化活性與疲勞狀況有較好的相關性，T-SOD活力、GSH-Px活力越強及MDA含量越低，運動產生的乳酸及尿素氮越少，越有利于糖原的儲備。其中，T-SOD活力與肌糖原含量的相關系數為0.85。GSH-Px活力與血清乳酸濃度的相關系數為0.85。MDA含量與肌糖原含量相關系數為0.91。這些結果說明，人參發酵前后樣品可以通過提高抗氧化酶活力，降低脂質過氧化物含量，保護機體免受氧化應激的損傷，起到抗運動疲勞的功效。

圖4 人參發酵前后樣品小鼠氧化應激指標與抗疲勞指標相關性分析結果Fig. 4 Correlation analysis between oxidative stress indexes and anti-fatigue indexes of mice administered with native or fermented ginseng products

3 討 論

尋找有效的方法來緩解運動引起的疲勞一直是研究人員的關注重點。在之前的研究中廣泛論證了人參皂苷的抗疲勞與抗氧化功效，Yang Qiyu等[29]研究表明Rg3可能通過提高脫乙酰酶SIRT1活力來改善運動表現和抗疲勞。稀有人參皂苷具有強大的藥理功效，微生物發酵法因轉化能力強被廣泛應用。Zheng Ziyi等[30]的研究表明人參葉發酵后人參皂苷Rh2和Rg3的含量顯著提高，可以安全地用于緩解運動引起的疲勞。本實驗在此基礎上利用復合菌種發酵白參、紅參、黑參以及人參漿果，不同人參加工品中總稀有人參皂苷含量依次為人參漿果＜白參＜紅參＜黑參，表明黑參發酵后稀有人參皂苷總含量較高，可能具有更強的藥理活性。進一步研究發現，與白參、紅參和人參漿果比較，黑參發酵后樣品組小鼠游泳力竭時間延長率達143.40%，血清尿素氮、血清乳酸、肌肉乳酸濃度明顯降低，糖原儲備效果明顯，說明發酵后的黑參抗疲勞效果更好。此外，通過測定MDA、GSH-Px、T-SOD水平分析不同組的氧化應激水平發現，灌胃發酵后樣品可明顯降低小鼠在急性運動期間的氧化應激水平，其中以發酵后黑參的效果最佳。

相關性分析結果表明，小鼠組織中T-SOD活力和GSH-Px活力與小鼠機體中的肝糖原和肌糖原含量呈正相關，與血清尿素氮、血清乳酸、肌肉乳酸濃度呈負相關，MDA含量則呈相反的效果。因此，發酵前后人參均可以通過提高抗氧化酶活力，降低脂質過氧化物含量，保護機體免受氧化應激的損傷，起到抗運動疲勞的功效。

本實驗結果表明，各組人參及人參漿果均表現出不同程度的機體保護作用，其中發酵后黑參制品具有更強的藥理功效，可作為疲勞應激誘導氧化損傷防護的功能性食品。此外，本實驗結果表明人參發酵后具有更強的藥理功效，提示人參制品的發酵處理可作為具有應用前景的人參加工技術。