基于正交偏最小二乘判別分析探究60Co-γ輻照對羊肚菌采后低溫貯藏品質的影響

郭 佳，陳 謙，徐 攀，王 艷，何 江，高 鵬,*

（1.四川省原子能研究院，四川 成都 610101；2.輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都 610101）

羊肚菌（Morchellasp.）作為珍稀的食藥用真菌，因其獨特“羊肚狀”凹陷和高營養價值受到世界范圍內高度重視[1]，并作為我國重要的出口創匯食用菌，年產量還在不斷提高。但因高含水量（相對含量約90%）、高呼吸速率以及缺乏避免水分流失和抵擋微生物侵染的表皮保護組織[2]，羊肚菌在采后貯藏、運輸和銷售過程中極易出現褐變、皺縮、軟化等劣變現象，嚴重影響其銷售品質和供應量，造成鮮菇價格的大幅度波動[3]。因此，探索一種有效的保鮮技術以延緩羊肚菌在貯藏期間的品質劣變和延長其貨架期具有重要意義。目前，食用菌的保鮮技術大致可分為用物理、化學和現代生物技術[4]。但化學保鮮和生物保鮮商業化操作復雜，易被病原微生物污染，且還可能造成營養成分流失等安全隱患[5]，所以市場上需要更加安全高效且簡便的保鮮技術。

60Co-γ輻照作為一種非熱加工的物理殺菌技術，能在保證產品品質不被破壞的基礎上，通過高能量電離輻射達到殺蟲、滅菌、防霉以及抑制后熟等效果，具有安全、環保、節能的特點[6]。作為一種食品保藏加工技術，在延緩食用菌子實體褐變、延長食用菌貨架期和增強抗氧化性等方面具有廣闊的應用前景[7]。但目前研究發現，品種的差異性和輻照劑量的選擇會直接影響輻照貯藏的效果。如1 kGy處理香菇不僅能維持子實體品質，還能促進酚類物質的積累，增強抗氧化性，但2 kGy處理則會加速子實體的軟化導致品質劣變[8]；同樣，2 kGy處理也會加速白靈菇子實體褐變[9]。而2 kGy處理卻能明顯延緩雙孢磨菇菌蓋開傘、菌柄伸長和子實體褐變，并延長貨架期至12 d[10]。盡管已有輻照技術對羊肚菌營養品質的探究以及選育優良菌株的報道，但輻照技術對羊肚菌采后品質影響和輻照劑量的篩選以及輻照劑量對品質變化影響的研究尚鮮見報道。因此，篩選合適的輻照劑量對深入推廣輻照技術在食用菌貯藏保鮮中的應用具有重要意義。

正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）作為一種有監督的多元判別分析統計方法，在產地溯源、快速分類判別和預測，以及差異的特征指標辨識方面準確性較高[11]。因此，本研究利用60Co-γ輻照技術對羊肚菌進行貯前處理，分析冷藏期間輻照處理對羊肚菌生理和生化指標的影響，并基于OPLS-DA建立輻照劑量與各品質指標間的關系模型，從新的角度尋找不同輻照劑量組之間的差異，以期為羊肚菌的輻照保鮮提供方法和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑脈羊肚菌（Morchella angusticeps）購于四川省金堂縣，采后冷鏈于當天運抵實驗室。選取外觀整齊、大小一致、無任何機械損傷和病蟲害的子實體裝入聚乙烯透明保鮮盒（19.5 cm×13.5 cm×5 cm）后進行實驗，每盒（100±5）g。

平板計數瓊脂 青島海博生物技術有限公司；氯化鈉、三氯乙酸、乙酸、乙酸鈉、鄰苯二酚、甲醇、鹽酸、硫酸、乙酸乙酯 成都市科龍化工試劑廠；硫代巴比妥酸、聚乙二醇PEG 6000、愈創木酚、蒽酮 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

200萬居里全自動FJx424-γ型輻照裝置 四川省原子能研究院輻照工程中心；TMS-Pro質構儀 美國FTC公司；CS-C600色差儀 杭州彩譜科技有限公司；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；SpectraMax M2多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司；906GP-超低溫冰箱 賽默飛世爾科技（中國）公司；PJ-400拍打式無菌均質機 上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 輻照處理及貯存條件

實驗組由四川省原子能研究院輻照中心的設備進行輻照處理，初始設定輻照劑量為1.5、2.0、2.5 kGy和3.0 kGy。采用Ag2Cr2O7劑量計進行劑量追蹤，確定實際輻照吸收劑量分別是1.64、2.18、2.43 kGy和2.93 kGy。以未輻照處理為對照組，并設定1.64 kGy和2.18 kGy為低劑量組，2.43 kGy和2.93 kGy為高劑量組，每個處理18 盒，貯藏期內均置于（4±1）℃、相對濕度85%冷藏室中，每隔一天進行相關指標測定。

1.3.2 質量損失率的測定

采用稱質量法[12]對每個時間點羊肚菌的質量進行測定。羊肚菌質量損失率計算如公式（1）所示。

1.3.3 菌柄硬度的測定

參照劉維等[13]的方法并稍作修改，利用TMS-Pro質構儀對羊肚菌菌柄進行硬度測定，形變量為70%。每組選擇6 個樣，每個樣在菌柄處隨機取3 個點測定。

1.3.4 菌柄色澤和褐變指數的測定

子實體的色澤采用色差儀垂直于羊肚菌菌柄表面測得的L*、a*和b*值表示，隨機取3 個羊肚菌分別測定3 處色澤。并參照Gao Mengsha等[14]的方法計算褐變指數（browning index，BI），如公式（2）、（3）所示。

1.3.5 微生物計數測定

菌落總數測定參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[15]。根據平板內的菌落數目和相應的稀釋倍數，計算出每克樣品所含的菌落總數/（CFU/g），結果以lg（CFU/g）表示。

1.3.6 生化指標測定

在貯藏期間每隔一天取菌柄菌蓋交界2～3 cm處組織，并迅速用液氮冷凍包裝后保存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于以下生化指標測定。

1.3.6.1 總酚、類黃酮含量和MDA含量測定

總酚、類黃酮含量的測定參照Pirie等[16]的方法稍作修改。取1.0 g樣品，加入預冷的4.0 mL體積分數1%鹽酸-甲醇溶液，冰浴研磨成漿，定容至20 mL，于4 ℃下避光提取20 min，12 000×g低溫離心15 min，取上清液分別在280 nm和325 nm波長處測定光密度值。體積分數1%鹽酸-甲醇溶液作空白參比校準液。總酚和類黃酮含量單位分別為OD280nm/gmf和OD325nm/gmf。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照Xi Yu等[17]的方法并稍作修改。取1 g樣品在7 mL體積分數10%三氯乙酸溶液中冰浴研磨，10 000×g低溫離心20 min，收集上清液后與質量濃度6.7 g/L硫代巴比妥酸混合，并于95 ℃水浴20 min，冷卻后，分別在450、523 nm和600 nm波長處測定光密度值，含量以nmol/g表示。

1.3.6.2 PPO、POD活力和CAT活力測定

取冷凍研樣后的樣品，參照Yuan Li[18]、Li Danqing[19]和Liu Qin[20]等的方法分別測定多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxidase，POD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力。酶活力單位均為U/gmf。

1.4 數據統計與分析

采用Excel 2010軟件進行數據平均值和標準誤的計算；采用SPSS 23.0統計軟件的Duncan’s法進行顯著差異性（P＜0.05）和配對t-檢驗（P＜0.05）分析；采用Origin 21.0軟件繪圖；采用Metabo-Analyst 5.0軟件（https://www.metaboanalyst.ca）進行OPLS-DA模型建立。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ輻照對羊肚菌采后生理及貯藏品質的影響

2.1.160Co-γ輻照對羊肚菌質量損失率和硬度的影響

子實體在貯藏期間會因蒸騰和呼吸作用發生失水現象，導致質量下降[21]。如圖1A所示，貯藏過程中處理組和對照組的羊肚菌質量損失率均逐漸升高。貯藏至第3天時，2.18、2.43 kGy和2.93 kGy處理組的質量損失率顯著低于對照組和1.64 kGy處理組（P＜0.05），且隨著貯藏時間的延長，1.64 kGy處理組的子實體質量損失率上升最緩慢，貯藏到第5天時質量損失率比對照組低24.9%，第9天時質量損失率顯著低于其他輻照處理組（P＜0.05）。結果表明，輻照處理能夠減少貯藏期間羊肚菌的質量損失，且1.64 kGy處理的羊肚菌效果最好。

圖1 輻照劑量對羊肚菌冷藏期間質量損失率（A）和硬度（B）的影響Fig. 1 Effects of different irradiation doses on mass loss rate (A) and hardness (B) of M. angusticeps during cold storage

硬度是反映子實體質地和貯藏保鮮效果的另一個重要指標[22]。由圖1B可知，羊肚菌菌柄的硬度隨著貯藏時間的延長而逐漸下降。與對照組相比，貯藏第3天時，除2.93 kGy處理組硬度上升外，其余各輻照處理組羊肚菌硬度緩慢下降。第5天時輻照處理組均與對照組存在顯著差異（P＜0.05），同時，對照組表皮結構開始發生明顯軟化。7 d后高劑量處理組硬度下降逐漸加快，略高于對照組但差異不顯著（P＞0.05），而1.64 kGy處理組仍維持一定硬度，顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，貯藏前一定劑量的輻照處理能有效維持羊肚菌的硬度，減緩組織結構的軟化。

2.1.260Co-γ輻照對羊肚菌色澤的影響

外觀品質是影響子實體貨架期和銷售性的重要指標。由圖2可見，隨貯藏時間的延長，菌蓋褶皺處開裂且褐色加深，菌柄從橫斷切口處褐變開始到整個菌柄發生嚴重褐變。與輻照處理組相比，對照組在第3天時先開始出現泛黃現象，并集中在橫斷切口處和菌柄菌蓋交界處。第5天時，對照組羊肚菌皺縮現象最明顯，且到第9天時，發生嚴重褐變現象。而各處理組在貯藏前5 d，羊肚菌在色澤和形態上無明顯差異，但在貯藏5 d后，高劑量組菌柄泛黃和皺縮程度不斷加劇，而1.64 kGy處理組仍保持一定色澤，菌柄皺縮現象也明顯得到緩解。

圖2 不同輻照劑量下羊肚菌子實體在貯藏期間的外觀變化Fig. 2 Changes in the appearance of M. angusticeps irradiated at different doses during storage

如圖3所示，對菌柄色澤變化的測定結果，在整個貯藏期間，對照組和處理組羊肚菌菌柄L*值均呈現下降趨勢。而高劑量處理組在貯藏前期L*值下降幅度緩慢，但在貯藏后期下降趨勢逐漸增大，且在貯藏7 d時，與1.64 kGy處理組存在顯著差異（P＜0.05）。羊肚菌菌柄BI在貯藏期內呈現上升趨勢（圖3B）。1.64 kGy處理組羊肚菌BI變化幅度最小，且在貯藏5 d后，與對照組間存在顯著差異（P＜0.05）。綜上，輻照處理能在一定程度上延緩子實體在低溫貯藏中外觀品質的劣變，其中1.64 kGy處理組延緩效果最好。

圖3 輻照劑量對羊肚菌貯藏期間L*值（A）和BI（B）的影響Fig. 3 Effects of different irradiation doses on L* value (A) and BI (B)of M. angusticeps during storage

2.1.360Co-γ輻照對羊肚菌的菌落總數影響

輻照處理通過高能射線直接影響羊肚菌子實體微生物的含量。由圖4可知，輻照處理組的菌落總數均顯著低于對照組（P＜0.05），且表現出隨著輻照劑量增加菌落總數逐漸降低的趨勢。

圖4 輻照劑量對羊肚菌貯藏期間菌落總數的影響Fig. 4 Effects of different irradiation doses on total bacterial count of M. angusticeps during storage

2.1.460Co-γ輻照對羊肚菌總酚和類黃酮含量的影響

總酚和類黃酮作為食用菌主要的抗氧化成分，其含量變化與子實體的風味形成和褐變密切相關[23]。由圖5可知，羊肚菌的總酚含量和類黃酮含量隨著貯藏時間延長所有組整體大都呈現出緩慢上升后下降的趨勢。貯藏第3天，高劑量處理組總酚含量和類黃酮含量均高于其他處理組和對照組，這可能是由于子實體為了抵御高劑量輻射的損傷作用，通過誘導酚類化合物的形成來增強子實體的抗性。但隨著貯藏期的延長，高劑量處理組上升趨勢緩慢，相反，低劑量輻照組含量迅速上升并在第7天達到峰值，1.64 kGy處理組含量最高，顯著高于對照組（P＜0.05）。結果表明，輻照處理能夠促使子實體酚類物質合成，從而提升自身抗性，延長貯藏期。

圖5 輻照劑量對羊肚菌貯藏期間總酚（A）和類黃酮（B）含量的影響Fig. 5 Effects of different irradiation doses on the contents of total phenols (A) and flavonoids (B) in M. angusticeps during storage

2.1.560Co-γ輻照對羊肚菌POD、CAT和PPO活力以及MDA含量的影響

如圖6所示，處理組和對照組POD活力變化在整個貯藏過程中呈逐漸上升的趨勢，CAT活力和PPO活力的變化均呈現先上升后下降的趨勢。輻照處理能明顯降低子實體POD活力，與對照組相比，5 d后1.64 kGy處理組能顯著降低POD活力（P＜0.05）（圖6A）。貯藏第5天時，對照組CAT活力達到峰值，隨著貯藏時間的延長迅速下降，而1.64、2.18、2.43 kGy和2.93 kGy處理組CAT活力繼續上升，在第7天時達到峰值，并顯著高于對照組（P＜0.05），分別比對照組高61.5%、37.4%、26.6%和33.9%（圖6B）。對照組PPO活力在貯藏第7天時到達峰值，與對照組相比，高劑量輻照處理組在貯藏前3 d顯著降低PPO活力（P＜0.05），但5 d后高劑量組僅略低于對照組（P＞0.05），而1.64 kGy處理組差異顯著（P＜0.05）（圖6C）。結果表明，高劑量輻照處理組在貯藏末期能夠促進PPO活力和POD活力增加，加速褐變進程。而低劑量組能夠有效降低POD活力和PPO活力，增加CAT活力，從而延緩羊肚菌的衰老。

圖6 輻照劑量對羊肚菌貯藏期間POD（A）、CAT（B）、PPO（C）活力和MDA含量（D）的影響Fig. 6 Effects of different irradiation doses on the activity of POD (A),CAT (B) and PPO (C) and MDA (D) content in M. angusticeps during storage

MDA作為膜脂過氧化反應的最終產物，其含量是衡量細胞膜透性的一個重要指標[24]。如圖6D所示，貯藏期間羊肚菌MDA含量呈現上升趨勢，且經輻照處理能明顯抑制MDA的積累，相比于2.93 kGy處理組在貯藏后期（5～9 d）迅速累積，1.64 kGy輻照處理組上升較緩慢，且與對照組積累量存在顯著差異（P＜0.05），抑制效果最好。結果表明，低劑量輻照處理能夠有效減緩細胞膜脂的過氧化，減輕輻照損傷。

2.2 多元統計分析結果

2.2.1 基于OPLS-DA模型的M. angusticeps處理組的差異區分

OPLS-DA屬于有監督統計的分析方法，相比于主成分分析方法和偏最小二乘判別分析法，其通過預設分類變量來剔除未控制變量對數據造成的影響，且能進一步挖掘數據信息和量化各處理組間的差異程度，因此，是一種非常適用于具有多線性和噪聲變量數據分類的分析方法[25]。

圖7展示了OPLS-DA的分析結果，兩模型都有較好的矩陣解釋率和模型擬合能力，貯藏末期組模型的穩定性更高[26]。貯藏末期組模型是對貯藏末期（5～9 d）輻照處理組和對照組子實體感官和理化品質指標的差異分析，由圖7A1可看出，各處理組單獨分布、無重疊，且相比于對照組，各輻照處理組在貯藏末期差異明顯，而高劑量輻照組接近對照組。而整個貯藏期組模型分析整個貯藏期（1～9 d）內輻照處理和對照組間的差異0.86），其中低劑量組分布于置信區間的左側，對照組分布在置信區間的右側，兩者間區分明顯（圖7A2），而高劑量組與對照組置信區間略有重合，差異不明顯。結果表明，1.64 kGy處理組的貯藏效果最好。

圖7 不同處理對羊肚菌貯藏末期（5～9 d）和整個貯藏期生理和生化指標的OPLS-DAFig. 7 OPLS-DA of physiological and biochemical indexes of M.angusticeps with different treatments in the late stage of storage (between days 5 and 9) and during the whole storage period

2.2.2 差異指標分析結果

為更深入地了解各處理組間的差異，找出對模型和各處理組分類判別影響強度和解釋能力起貢獻作用的變量，分別對模型預測變量中的重要性變量進行評估[27]。通過變異權重參數值（variable importance in the projection，VIP）（閾值＞1）和S-plot圖篩選出影響各處理組的差異指標。貯藏末期（5～9 d），POD活力、類黃酮含量、CAT活力和PPO活力、總酚含量以及硬度這6 個指標是影響輻照處理組和對照組間差異的主要特征指標（圖7B1和圖7C1）。此外，CAT、POD活力、硬度和總酚含量4 個指標也是區別低劑量組和高劑量組間的差異指標（圖7B2、C2）。其次，通過聯系配對t-檢驗，篩選出CAT、POD活力和硬度是區分1.64 kGy處理組和對照組差異貢獻度最大的顯著指標（P＜0.05）（表1）。綜合上述結果，不同劑量輻照處理均能影響羊肚菌子實體貯藏效果。其中，1.64 kGy處理組和對照組差異最大，表現為能延緩子實體的腐爛變質，進而延長貨架期。

表1 區分1.64 kGy處理組與對照組的顯著差異指標結果Table 1 Identification of significantly differential indicators between 1.64 kGy irradiation and control groups

3 討 論

羊肚菌采后生理活動旺盛，且具有特殊的中空結構和組織脆嫩性，導致品質劣變造成的采后損失非常嚴重。輻照技術對微生物作用明顯，已被廣泛應用于食品衛生和安全性領域。除此之外，輻照保鮮作為近年來研究的熱點內容，也開始應用到食用菌的保鮮研究中。食用菌作為水分含量高的農產品，研究發現60Co-γ輻照技術主要是通過輻照電離食用菌細胞內的水分子，利用產生氫自由基和羥自由基等活性成分間接作用于細胞成分，還通過輻照射線作用于碳水化合物和脂質等化學成分影響酶活力和活性成分含量，減慢相關生理代謝反應速率和延緩子實體的衰老，最終達到保鮮的效果[28]。本研究發現，輻照處理聯合采后低溫貯藏能通過激活羊肚菌氧化酶活力，刺激抗氧化系統，從而延緩羊肚菌子實體的衰老和品質劣變。

羊肚菌的褐變和軟化作為采后貯藏保鮮品質劣變的主要現象，表現為菌柄褐度上升、萎縮且硬度降低、菌蓋褶皺脫落以及內容物外溢。研究表明，引起子實體品質劣變與活性氧自由基積累、MDA等有害物質的產生密切相關[29]。在貯藏過程中由于子實體的呼吸、蒸騰等新陳代謝活動消耗了大量的營養物質，使活性氧自由基的動態平衡被破壞[30]。而隨著氧化產物的積累，胞內的酶促反應加速，引起膜脂過氧化及其產物MDA含量的上升，致使細胞膜透性增加和酚-酚酶區室化分布被打破。PPO作為影響褐變發生的關鍵酶，貯藏過程中其活力逐漸升高，并與酚類物質氧化聚合生成黑色素，導致子實體褐變發生[31]。此外，作為反映細胞膜脂過氧化程度的MDA，還會繼續與胞內大量的游離氨基酸等成分作用生成脂褐素，進一步加速子實體的褐變和軟化[32]。本研究發現，與對照組相比，輻照處理能顯著降低貯藏期間羊肚菌的質量損失，延緩子實體的褐變和MDA含量的積累。目前的研究表明，輻照處理能通過激活植物體內的相關保護酶來應對活性氧爆發，輻照產生的H2O2則作為活性氧爆發早期激活機體產生相關防御反應的信號傳導分子[33]。CAT作為重要的H2O2清除劑，其活力直接反映了細胞免受活性氧損害的程度[34]。本研究發現，CAT作為區別輻照前后羊肚菌的差異指標，輻照處理在顯著提高酶活力的同時，還能夠推遲活力峰值的出現，推遲原因可能是非酶促抗氧化系統在貯藏前期占主導作用。總酚和類黃酮作為植物體的抗氧化成分，經輻照處理后能通過誘導糖苷類物質和細胞壁多糖發生降解轉化而引起含量上升[35]，但伴隨著清除過程的進行，則又與PPO發生酶促褐變而導致含量下降。酶促和非酶促抗氧化系統共同構成細胞抗氧化防御系統的關鍵組成部分。而POD作為另一個清除H2O2的氧化酶，本研究發現，在整個貯藏過程中，輻照處理均降低了羊肚菌POD活力，這與Liu Qin等[20]研究香菇貯藏保鮮的結果一致。表明POD可能也參與了酚類物質的氧化，與PPO一樣引起果實的褐變[36]。因此，輻照處理羊肚菌能通過增強抗氧化能力保持膜完整性，并通過減少酚類底物的氧化來抑制酶促褐變反應發生。

此外，本研究發現，高劑量輻照處理的羊肚菌在貯藏前期表現出了較高的氧化酶活力、總酚含量和類黃酮含量，這可能是由于高劑量輻照破壞子實體細胞壁，通過誘導非生物脅迫產生活性氧，提高了機體的抗氧化能力，另外也有研究表明，高劑量輻照處理可能通過誘導苯丙烷代謝，刺激苯丙氨酸解氨酶活力升高，調節了抗氧化系統[37]。其中，POD也作為參與苯丙烷代謝的氧化酶，含量的上升能引起果實的木質化，并促進采后愈傷[38]，但在本研究中，作為區分輻照處理間差異的顯著指標，對照組POD活力逐漸升高，貯藏期內逐漸軟化，輻照處理則表現出較低的POD活力，較好地維持了羊肚菌的硬度，與Liu Qin等[20]的報道一致。而至于輻照處理如何影響苯丙烷代謝途徑以及是否引起木質化尚有待進一步揭示。

4 結 論

本研究用4 種輻照劑量處理黑脈羊肚菌后進行低溫貯藏保鮮實驗，并基于OPLS-DA建立指標判別模型來分析輻照處理前后以及各輻照處理間的差異。結果表明，經低劑量輻照處理的羊肚菌，特別是1.64 kGy處理能明顯減輕子實體的質量損失，能通過抑制褐變相關酶活力和刺激抗氧化系統，減輕子實體的軟化和褐變，保鮮效果最好。而結合OPLS-DA多元統計模型能較好地對羊肚菌各處理組進行區分，篩選出影響有無輻照處理的差異指標是CAT活力，影響各輻照處理組效果的差異指標是POD活力。研究可為后續羊肚菌輻照保鮮的工業化應用提供數據支持。