BRAF突變型黑色素瘤的耐藥性機制及治療最新研究進展

李細媛，朱智鑫，趙海龍△

黑色素瘤是一種源自皮膚、黏膜、葡萄膜和腦膜等部位黑色素細胞的惡性腫瘤，每年黑色素瘤患者病死率超過3.5%，轉移性黑色素瘤患者的5年生存率僅為15%~20%［1］。黑色素瘤早期主要通過手術切除治療，深度轉移或已擴散至淋巴結者主要依賴免疫療法、化療和放療等治療手段［2］。在進展為黑色素瘤過程中，黑色素細胞常伴隨絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路相關基因突變或蛋白過度激活，導致細胞增殖水平和侵襲能力過度增強［3］。約50%的黑色素瘤患者存在鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（BRAF）突變，其中最常見的為BRAFV600E突變［4］。

目前臨床上BRAF突變型黑色素瘤的靶向治療藥物以BRAF抑制劑和絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（MEK）抑制劑組合為主，臨床效果顯著，患者腫瘤抑制率和總生存期均有明顯改善［5］。然而，目前臨床上已經出現大量對BRAF抑制劑或聯合MEK抑制劑治療黑色素瘤產生耐藥性的病例，尤其在治療后期出現了嚴重的藥物相關不良反應并進一步發生腫瘤的惡性化轉移［5］。本文重點討論單藥型BRAF抑制劑或聯合MEK抑制劑治療BRAF突變型黑色素瘤耐藥性產生的機制，并歸納總結耐藥后靶向治療和免疫治療的最新研究進展。

1 BRAF突變型黑色素瘤耐藥性的發生機制

BRAF突變型黑色素瘤耐藥性主要分為原發性耐藥性、適應性耐藥性和繼發性耐藥性，發生機制較為復雜，涉及腫瘤細胞內以及腫瘤微環境中基因、表觀遺傳和代謝等多方面變化［6］。

1.1 原發性耐藥性 約20%接受BRAF抑制劑治療的BRAFV600E突變型黑色素瘤患者在初次治療期間即出現病情惡化且發生轉移，說明部分黑色素瘤在發生發展初期就已經具有內在耐藥性［7］。研究表明，在BRAFV600E突變的黑色素瘤細胞系和原位腫瘤中，內在基因突變和源自腫瘤細胞或基質的內源性分泌因子是誘發針對BRAF抑制劑原發耐藥性的驅動因素之一［6］。

人第10號染色體缺失的磷酸酶-張力蛋白同源的基因（PTEN）是一種抑癌基因，也是磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號通路的主要調節因子。BRAF突變型黑色素瘤中頻發內源性PTEN突變和缺失［8］。He等［8］研究表明，PTEN缺失會激活BRAF突變型黑色素瘤中MAPK和PI3K-蛋白激酶B（AKT）信號通路，并通過抑制細胞凋亡蛋白Bcl-2相關性調節蛋白（BIM）介導的細胞凋亡進而誘發內在耐藥性。Griewank等［9］發現，在BRAF突變型黑色素瘤中，視網膜母細胞瘤基因（RB）信號通路的失調驅動MAPK/PI3K信號通路的激活，進而引發細胞不受控制地增殖。此外，黑色素瘤細胞中RB信號通路中p16缺失的原因有細胞周期蛋白依賴激酶抑制因子2A（CDKN2A）的缺失（50%～80%）、失活突變（16%）和表觀遺傳沉默（20%）［9］。Smalley等［10］發現在BRAFV600E突變型黑色素瘤中細胞周期蛋白D1（CCND1）存在過表達情況，與BRAF抑制劑耐藥性的形成呈正相關。

大鼠肉瘤病毒癌基因同源（RAS）相關的C3肉毒素底物1（RAC1）作為Rho家族的小GTP結合蛋白，參與調節細胞增殖、細胞骨架重構和細胞遷移。其中RAC1P29S是黑色素瘤中繼BRAFV600E（50%）和NRASQ61（20%）之后的第三大常見熱點突變，占4%。RAC1P29S是一種激活性突變，促使RAC1發生磷酸化，導致細胞的增殖和遷移水平提高［11］。Uribe-Alvarez等［12］研究表明，BRAFV600E突變型黑色素瘤中內源性RAC1P29S與對BRAF抑制劑的早期耐藥性有關，并且沉默RAC1P29S表達可以恢復細胞對BRAF抑制劑的敏感性。

神經纖維素-1（NF-1）是一種腫瘤抑制因子，可以通過抑制RAS表達來限制MAPK信號通路的激活。Tangella等［6］研究表明NF1的表達缺失與BARF抑制劑的耐藥性呈正相關，尤其是在使用BRAF抑制劑維莫非尼（Vemurafenib）治療黑色素瘤產生耐藥性的患者中頻發內源性NF-1基因突變。

MEK1/2蛋白是BRAF蛋白的下游分子，可促進細胞外調節蛋白激酶（ERK）磷酸化和MAPK信號傳導［13］。Wagle等［14］研究發現，MEK1C121S的突變與細胞對BRAF和MEK抑制劑耐藥性形成有關。同樣，Carlino等［15］在使用BRAF抑制劑治療BRAF突變型黑色素瘤時發現，內源性MEK1P124突變導致的耐藥性是患者無進展生存期縮短的主要原因之一。

1.2 適應性耐藥性 臨床中應用BRAF抑制劑治療后，黑色素瘤患者在治療初期多數會出現腫瘤區域縮小，但黑色素瘤體不會完全消失［1］。目前普遍認為這是BRAF抑制劑誘導出現的補償機制，可促使部分原始腫瘤細胞的存活能力增強，進而出現抑制劑治療耐受情況，稱為適應性耐藥性。適應性耐藥性的發生是可逆的，且不具有遺傳性［6］。

小眼畸形相關轉錄因子（MITF）作為對黑色素細胞的早期生長和分化至關重要的主調控因子，參與黑色素瘤細胞侵襲、生存、細胞周期調節、自噬等諸多生物學過程［16］。在不同類型的黑色素瘤患者中MITF表達水平不一［17］。其中，MITF高表達患者出現原發黑色素瘤體積增大和增殖水平提高的現象，而MITF低表達患者則多出現侵襲性更高的轉移性黑色素瘤［16］。Rathore等［18］發現耐藥型黑色素瘤細胞系中MITF低表達，但侵襲性相關的核因子（NF）-κB信號通路和AXL的表達水平反而較高，說明MITF低表達與黑色素瘤耐藥性表型的形成以及惡性程度增高存在密切關聯。相反，Smith等［19］研究認為由配對盒基因（PAX3）介導的MITF高表達是黑色素瘤細胞早期非突變和可逆的藥物耐受狀態的驅動因素。如上所述，雖然黑色素瘤增殖和侵襲均參與黑色素瘤耐藥性形成，但MITF呈現出截然相反的表達水平。此外，研究表明BRAF抑制劑治療后黑色素瘤細胞在增殖和侵襲狀態之間的表型轉換，促使腫瘤細胞在早期治療中快速適應和存活，導致耐藥性出現［17］。但是，由于MITF參與的生物學過程十分復雜，其不同表達水平導致黑色素瘤進展方向不同的原因和機制尚不清楚，有待進一步研究。

1.3 繼發性耐藥性 繼發性耐藥性主要指最初有治療效果并伴隨腫瘤消退的患者在后續治療過程中出現復發情況，是黑色素瘤患者最主要的耐藥類型。繼發性耐藥性的產生主要與MAPK信號通路中基因突變情況有關，后者誘導MAPK信號通路過度激活或利用替代通路（如PI3K-AKT通路）繞過MAPK信號通路，進而導致腫瘤細胞過度增殖［20］。Johnson等［21］研究發現部分基因突變參與黑色素瘤繼發性耐藥性的產生，包括NRAS或KRAS突變、BRAF剪接變體、BRAFV600E/K擴增以及MEK1/2突變。

受體酪氨酸激酶（RTKs）是MAPK信號通路的上游蛋白。Sullivan等［22］已證明RTKs的上調可以通過激活RAS蛋白而直接激活MAPK信號通路。此外，胰島素樣生長因子1受體（IGFR1）、血小板衍生生長因子受體（PDGFR）β等均可上調RTKs表達，同時經非ERK依賴途徑激活PI3K-AKT通路［22］。臨床研究表明，BRAF抑制劑治療可導致部分黑色素瘤細胞的RTKs表達水平上調，同時伴隨MAPK信號通路或替代的PI3K-AKT信號通路激活，進而提高細胞增殖水平并形成耐藥性［23］。

Yin等［24］研究發現在約28%的黑色素瘤中存在NRAS激活性突變，其中最常見的是NRASQ61R突變。NRAS突變體在被激活表達后通過誘導絲氨酸/蘇氨酸激酶（RAF）的二聚化進而激活MAPK通路［24］。此外，在BRAFV600E突變型黑色素瘤中MEK1突變被證實與對BRAF抑制劑產生的繼發性耐藥性存在正相關［15］，同時，MEK1/2的組成性激活或藥物結合位點的突變，還可以導致對MEK抑制劑耐藥性的發生［25］。Little等［26］研究證實BRAFV600E突變擴增也是導致對MEK抑制劑產生耐藥的主要因素，BRAFV600E擴增通過激活MEK，進而激活MAPK信號通路的下游組成蛋白來驅動細胞增殖，形成耐藥性。

BRAFV600E剪接變體也可以產生對BRAF抑制劑的耐藥性。Clark等［27］研究發現在耐藥型BRAFV600E黑色素瘤細胞中存在異常剪接的BRAFV600E異構體，即p61BRAFV600E，該異構體缺乏包括RAS結合域（RBD）在內的外顯子3-5，能夠不依賴RAS途徑進行二聚化，進而形成耐藥性。Jiang等［28］研究發現PI3K與MAPK通路之間存在交叉傳達，耐藥型BRAF突變型黑色素瘤通過避開BRAF和MEK抑制劑靶向的蛋白位點，利用替代通路中AKT蛋白激活MAPK信號通路中的ERK以促進細胞生存。

總之，在單藥型BRAF抑制劑和（或）MEK抑制劑聯合治療過程中是否產生繼發性耐藥性很大程度上取決于MAPK通路或替代通路的激活情況，而相關通路蛋白能夠起到提示惡性程度的作用。此外，通過RTKs表達上調直接影響上述通路中部分基因表達水平也是耐藥性產生的關鍵機制之一。然而，目前關于原發性耐藥性和適應性耐藥性發生機制之間的關聯與區別仍不明確，還需進一步研究來闡明耐藥性發生機制，以尋找新的治療模式組合，以期同時預防2種耐藥的發生。

2 耐藥型BRAF突變型黑色素瘤治療方案優化的現狀及前景

如上所述，單藥型BRAF抑制劑和（或）MEK抑制劑聯合治療BRAF突變型黑色素瘤均易產生耐藥性，因此開發BRAF與MEK以外的其他靶點特異性藥物或新的治療方式已成為目前的研究熱點。

2.1 ERK抑制劑 原發性和繼發性耐藥性主要涉及MAPK信號通路的重新激活，但通過抑制BRAF和MEK以阻礙MEK過度激活MAPK通路，仍然可能出現耐藥性［6］。ERK在MAPK/ERK通路中發揮著獨特的作用，可以使100多種不同的底物磷酸化，參與MAPK/ERK的激活或去激活反饋回路，而且只有1個MEK1/2的上游效應物。ERK的重新激活是大多數繼發性耐藥性機制的核心。因此，ERK抑制劑目前被認為是可以有效抑制MAPK通路并且減少耐藥性產生的靶點［29］。

Germann等［30］發現Ulixertinib/BVD-523是一種新型的、可逆的、腺苷三磷酸（ATP）競爭性的ERK1/2抑制劑，具有高效能和ERK1/2選擇性。在BRAFV600E突變型黑色素瘤細胞系異種移植模型中，Ulixertinib/BVD-523與BRAF抑制劑聯合使用時產生了協同抗腫瘤增殖作用［30］。同樣，在BRAF/MEK聯合靶向治療后產生繼發性耐藥的動物模型中，單藥ERK抑制劑在體內外均有顯著的抗腫瘤活性［31］。目前美國食品藥物監督管理局（FDA）已將Ulixertinib/BVD-523列為治療轉移性BRAFV600E突變型黑色素瘤的快速通道藥物之一［30］。

SCH772984是一種新型選擇性的ERK1/2抑制劑，在BRAF、NRAS或KRAS突變的黑色素瘤細胞中具有納摩爾效力，并能在可耐受的劑量下誘導異種移植動物模型腫瘤消退［32］。SCH772984還能有效地抑制對BRAF和MEK抑制劑聯合靶向治療耐藥的黑色素瘤細胞中的MAPK信號傳導和細胞增殖［32］。除此之外，還有較多處于臨床試驗階段或臨床試驗完成但結果尚未公布的ERK抑制劑，如LY3214996［33］、GDC0994［34］等。ERK抑制劑已經是治療BRAFV600E突變型黑色素瘤耐藥性的研究熱點之一。

2.2 AXL抑制劑 通過上述耐藥性發生機制可見，RTKs是黑色素瘤適應性和繼發性耐藥性機制的重要組成成分。RTKs家族由Tyro-3、AXL和Mer組成，尤其是AXL異常表達與癌癥的發展、耐藥性有關，并參與包括黑色素瘤在內的多種腫瘤免疫逃逸；而在BRAF突變型黑色素瘤細胞系中也頻發AXL高表達、MITF低表達的耐藥表型［18］。已有研究探討AXL抑制劑治療耐藥型BRAF突變型黑色素瘤的效果，如尚在臨床試驗階段的BGB-324/Bemcentinib（Ⅰ型）［35］、LDC1267（Ⅱ型）［36］等。

AXL-1047-MMAE是一種抗體偶聯藥物（ADC），可以在黑色素瘤動物模型體內外誘發細胞毒性。以AXL抑制劑為基礎的ADC治療不僅可以防止BRAF抑制劑耐藥性產生，而且能增強BRAF和MEK抑制劑聯合使用的療效，共同抑制耐藥細胞生長，并且對MAPK通路抑制劑有抗性的黑色素瘤具有顯著療效［37］。

2.3 抗程序性死亡受體/配體-1（PD-1/PD-L1）抗體 針對黑色素瘤的免疫原性，以PD-1及其配體PD-L1為靶點的免疫治療是目前臨床研究熱點之一。PD-1是一種重要的免疫抑制分子，通過抑制T細胞活性來抑制免疫系統，而抗PD-1單克隆抗體能夠阻斷PD-1受體，維持T細胞激活狀態以抑制腫瘤生長［38］。因此靶向PD-1的抗體，無論是單一療法還是與抗細胞毒T淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）藥物聯合治療在臨床上已經顯示出治療轉移性黑色素瘤的前景［39］。

尼伏單抗（Nivolumab）是一種人IgG4抗PD-1單克隆抗體，可以特異性附著于T細胞的PD-1受體上，防止T細胞的失活。其與另一種針對淋巴細胞中PD1受體的人源化單克隆抗體潘利珠單抗（Pembrolizumab）于2014年被FDA批準用于黑色素瘤的治療［40］。針對PD-L1的IgG1同種型的全人源化單克隆抗體阿替珠單抗（Atezolizumab），以及另一種可同時阻斷PD-L1與PD-1和CD80分子相互作用的單克隆抗體度伐單抗（Durvalumab），尚處于驗證BRAF突變型黑色素瘤患者治療效果的臨床試驗階段［1］。

最新研究表明，靶向治療與免疫治療的聯合使用可以加強對腫瘤生長的控制，但伴有明顯的不良反應，比如肝功能不全、熱射病等［41］。同時，靶向治療和免疫治療的給藥先后順序也有局限性，如MAPK靶向治療可能誘導腫瘤出現抗PD-1的轉錄特征，從而形成針對免疫治療的耐藥性［42］。

2.4 抗CTLA-4抗體 除PD-1外，CTLA-4也是黑色素瘤治療過程中的重要靶點之一［39］。CTLA-4在調節性T細胞和衰竭的活化T細胞上表達，與T細胞表面受體CD28共享B7配體（CD80和CD86）。當CTLA-4與抗原提呈細胞的B7配體（CD80和CD86）結合后，通過內吞轉運作用抑制T細胞激活，產生免疫抑制反應。因此，腫瘤細胞可通過表達CTLA-4及相關受體蛋白，發揮后者的免疫抑制特性，進而能夠逃避T細胞及相關免疫反應的攻擊，完成免疫逃逸［43］。

伊匹單抗（Ipilimumab）于2011年被FDA批準作為抗CTLA-4單克隆抗體藥物，用于治療不可切除或轉移性的黑色素瘤［40］。2015年FDA批準Ipilimumab聯合Nivolumab治療黑色素瘤，但該組合容易出現藥物毒性反應，目前，在保持原有療效的情況下，通過改變藥物劑量或調整給藥順序以減少該藥物毒性反應的研究尚處于臨床試驗階段［40］。其他抗CTLA-4抗體藥物如替西木單抗（Tremelimumab）、BCD-145治療黑色素瘤的研究仍在臨床試驗階段［1］。

2.5 表觀遺傳療法 近年來表觀遺傳學是基因表達調控研究的熱點之一，異常的表觀遺傳修飾能夠通過誘導腫瘤細胞產生耐藥性，從而降低化療藥物的效果［44］。因此，逆轉或修復異常表觀遺傳修飾可以為治療耐藥型BRAF突變型黑色素瘤提供新的治療思路［45］。DNA甲基化是最早被發現、研究最深入的表觀遺傳調控機制之一，然而在黑色素瘤治療過程中DNA甲基化狀態異常與耐藥性形成機制的關系暫不明確，同時相關DNA甲基化轉移酶（DNMT）抑制劑臨床研究不夠深入，DNMT抑制劑能否有效降低BRAF突變型黑色素瘤耐藥性并改善治療效果還需進一步研究與探討。

3 總結與展望

綜上，隨著耐藥性機制研究的逐步細化和深入，靶向治療藥物的選擇范圍也在逐漸擴大，包括新的BRAF和MEK抑制劑，以及其他靶點抑制劑的單藥使用或聯合使用。此外，免疫治療也是一個新的關注領域，多種相關藥物正處于研究或臨床試驗階段，就目前試驗效果來看，有可能實現對BRAF突變型黑色素瘤的長效控制。針對耐藥型BRAF突變型黑色素瘤迫切需要進一步的基礎和臨床研究，開發臨床應用范圍更廣的靶向藥物以及改善免疫微環境的個性化免疫治療方案，提供更多的研究數據以便制定聯合用藥的最優療程與組合方式。