不同蔗糖濃度對(duì)索邦百合離體繁殖與植株再生的影響

李衛(wèi)東 其麥鄧珠 其麥翁姆 趙心怡 陳鐘吼 劉 帆*

（1白玉藏品農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司，四川白玉 627150；2四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，四川成都 611130）

百合（Lilium brownii var.viridulum Baker）是百合科百合屬植物的統(tǒng)稱，為多年生草本球根植物，原產(chǎn)于中國(guó)。百合花色豐富、花形各異、芳香宜人，是名貴的切花和盆花，其大部分鱗莖既可食用又能藥用[1-2]。東方百合有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是世界四大切花之一[3]。索邦百合屬于東方百合，植株高80～120 cm，莖稈硬度大，葉較狹長(zhǎng)，呈披針形，亮綠，有光澤，花呈粉紅色，邊緣具狹窄白邊，紅色乳突分布于花瓣中部以下，有香味[4]。

目前，我國(guó)切花產(chǎn)業(yè)中東方百合所占的比重越來(lái)越大，是栽培的主要新品種。生產(chǎn)上百合繁殖主要采用常規(guī)分球、分珠芽、鱗片扦插、鱗片包埋等繁殖方法。但是，生產(chǎn)上百合繁殖量較小，繁殖速度緩慢[5-6]，短期內(nèi)難以滿足市場(chǎng)需求。連續(xù)多代繁殖，百合易發(fā)生病毒病，最終導(dǎo)致種球產(chǎn)量下降，花色變淡，花冠變小，觀賞價(jià)值降低[7-10]。組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用極大地提高了東方百合的繁殖系數(shù)，且易保持原品種的優(yōu)良觀賞特性[11]，對(duì)保護(hù)此品種資源具有重要意義。

本試驗(yàn)探究了在最適宜的激素濃度配比下，不同濃度蔗糖對(duì)索邦百合組織培養(yǎng)的影響，以期為建立高質(zhì)量的索邦百合快速離體繁殖體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以植株健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的百合作為試驗(yàn)材料。此材料采自市場(chǎng)，經(jīng)鑒定為索邦百合。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 前期處理。具體包括外植體選取與滅菌、培養(yǎng)基配制兩方面內(nèi)容。

（1）外植體選取與滅菌。以索邦百合鱗莖作為外植體，用流水沖洗鱗莖1～2 h，剝?nèi)[莖外皮及外部2～3層鱗片，切去少許頂部及基部，用75%乙醇浸泡15 s，用無(wú)菌水洗2～3次，再使用0.1%升汞溶液處理8 min，用無(wú)菌水洗4～6次后備用。

（2）培養(yǎng)基配制。①愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基，添加6 g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值至5.8。根據(jù)添加蔗糖濃度的不同，設(shè)6個(gè)處理，見(jiàn)表1。②誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基。以M5為基本培養(yǎng)基，添加6 g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值至5.8，添加誘導(dǎo)愈傷組織分化形成叢生芽的最佳濃度配比的激素（6-BA 1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L）和對(duì)應(yīng)濃度的蔗糖。共設(shè)6個(gè)處理，具體見(jiàn)表2。③誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基。以1/2MS（大量元素減半）為基本培養(yǎng)基，添加6 g/L瓊脂粉，調(diào)節(jié)pH值至5.8，添加誘導(dǎo)叢生芽生根的最佳濃度配比的激素（IBA 0.25 mg/L、NAA 0.1 mg/L）和對(duì)應(yīng)濃度的蔗糖。共設(shè)6個(gè)處理，具體見(jiàn)表3。

表1 愈傷組織生長(zhǎng)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

表2 誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

表3 誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基設(shè)計(jì)

1.2.2 試驗(yàn)過(guò)程。主要包括不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)、叢生芽生長(zhǎng)、壯苗生根的影響以及煉苗移栽等方面內(nèi)容。

（1）不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響。將鱗片切成2 cm×1 cm的小塊，接種于放置3 d的無(wú)污染培養(yǎng)基中。每個(gè)處理5瓶，每瓶接種3塊。轉(zhuǎn)接完畢后將培養(yǎng)瓶置于（22±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中遮光培養(yǎng)。

將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接至愈傷組織生長(zhǎng)效果最佳的培養(yǎng)基內(nèi)，置于光照強(qiáng)度2 000 lx、溫度（22±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d，增殖時(shí)間為30 d。每3 d觀察記錄1次試驗(yàn)現(xiàn)象，30 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織數(shù)目和發(fā)生時(shí)間，記錄愈傷組織的生長(zhǎng)情況，篩選出最佳蔗糖濃度。相關(guān)公式如下：

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=愈傷組織數(shù)/接種數(shù)

（2）不同蔗糖濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響。將小鱗莖上長(zhǎng)至3～4 cm的叢生芽分成單芽，接入誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理5瓶，每瓶接種3塊。轉(zhuǎn)接完畢后將培養(yǎng)瓶置于（22±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 lx，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d。

將誘導(dǎo)出的叢生芽轉(zhuǎn)接至叢生芽生長(zhǎng)效果最佳的培養(yǎng)基內(nèi)，置于光照強(qiáng)度 2 000 lx、溫度（22±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光照時(shí)長(zhǎng)12 h/d，增殖時(shí)間為30 d。每3 d觀察記錄1次試驗(yàn)現(xiàn)象，30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽數(shù)目、誘導(dǎo)率、發(fā)生時(shí)間，記錄叢生芽生長(zhǎng)情況、篩選出最佳蔗糖濃度。相關(guān)公式如下：

叢生芽誘導(dǎo)率（%）=萌芽數(shù)/接種數(shù)

（3）不同蔗糖濃度對(duì)壯苗生根的影響。將生長(zhǎng)狀況良好的叢生芽切成單芽接入誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基中。每個(gè)處理5瓶，每瓶接種3塊。轉(zhuǎn)接完畢后將培養(yǎng)瓶置于（22±2）℃的恒溫培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，光照條件同上。每3 d觀察記錄1次試驗(yàn)現(xiàn)象，30 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽生根數(shù)目、誘導(dǎo)率和發(fā)生時(shí)間，記錄根的生長(zhǎng)情況，篩選出最佳蔗糖濃度。相關(guān)公式如下：

生根誘導(dǎo)率（%）=生根數(shù)/接種數(shù)

（4）煉苗移栽。將生長(zhǎng)健壯的組培苗置于室溫條件下煉苗3 d后，揭開(kāi)瓶口繼續(xù)煉苗3 d。取出培養(yǎng)瓶苗，用清水和毛刷將植株根系的培養(yǎng)基沖洗干凈，再用多菌靈800倍液消毒基質(zhì)15 min，然后將培養(yǎng)瓶苗栽植于基質(zhì)（腐殖質(zhì)∶蛭石=2∶1）中，并為植株套上帶有微孔的保鮮袋。每天在植株葉面噴霧2次，保持植株表面濕潤(rùn)，培養(yǎng)7 d。7 d后待植株有新葉長(zhǎng)出，取掉保鮮袋，觀察其生長(zhǎng)情況，調(diào)查其移栽存活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蔗糖濃度對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)的影響

從表4可以看出，適宜誘導(dǎo)愈傷組織的蔗糖濃度范圍為60～80 g/L，其愈傷組織的誘導(dǎo)率均達(dá)到了100%。愈傷組織的誘導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)隨著蔗糖濃度的升高而增加，而當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)升高時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率則開(kāi)始下降。愈傷組織發(fā)生時(shí)間在試驗(yàn)所設(shè)置的蔗糖濃度范圍內(nèi)隨著蔗糖濃度的升高而減短。其生長(zhǎng)速度在一定范圍內(nèi)隨著蔗糖濃度的升高而加快，顏色在一定范圍內(nèi)也隨著蔗糖濃度的升高而由淺變深。綜合比較發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)的蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，愈傷組織質(zhì)地最好，呈濕潤(rùn)的瘤狀突起，顏色為綠色（圖1）。

表4 愈傷組織誘導(dǎo)情況統(tǒng)計(jì)

圖1 60 g/L蔗糖誘導(dǎo)的愈傷組織

2.2 不同蔗糖濃度對(duì)叢生芽生長(zhǎng)的影響

從表5可以看出，適宜誘導(dǎo)愈傷組織分化形成叢生芽的蔗糖濃度范圍為20～40 g/L，叢生芽的發(fā)生時(shí)間隨著蔗糖濃度的升高而縮短。叢生芽誘導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)隨著蔗糖濃度的升高而增加；當(dāng)蔗糖濃度為40 g/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率達(dá)到最大值（100%），此時(shí)芽葉顏色呈綠色（健康狀態(tài)）；當(dāng)蔗糖濃度超過(guò)40 g/L時(shí)，叢生芽的誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì)，且芽葉顏色隨著蔗糖濃度的升高而變淺、發(fā)黃，甚至枯萎；當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，芽、葉的生長(zhǎng)速度最快，而當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)升高時(shí)，其生長(zhǎng)速度逐漸減緩。綜合比較發(fā)現(xiàn)，最佳誘導(dǎo)愈傷組織分化形成叢生芽的蔗糖濃度為 40 g/L（圖2）。

表5 叢生芽誘導(dǎo)情況統(tǒng)計(jì)

圖2 40 g/L蔗糖誘導(dǎo)的叢生芽

2.3 不同蔗糖濃度對(duì)壯苗生根的影響

從表6可以看出，適宜叢生芽誘導(dǎo)分化形成不定根的蔗糖濃度范圍為40～60 g/L。生根數(shù)與生根誘導(dǎo)率在一定的蔗糖濃度范圍內(nèi)都隨著蔗糖濃度的升高而增加；當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，生根數(shù)與生根誘導(dǎo)率達(dá)到最大值；當(dāng)蔗糖濃度繼續(xù)上升時(shí)，生根數(shù)與生根誘導(dǎo)率開(kāi)始下降。不定根的誘導(dǎo)時(shí)間在一定的蔗糖濃度范圍內(nèi)隨著蔗糖濃度的升高而呈現(xiàn)縮短趨勢(shì)；當(dāng)蔗糖濃度為40 g/L時(shí)，不定根誘導(dǎo)的時(shí)間最短，為18 d。不定根的生長(zhǎng)情況也隨著蔗糖濃度的升高而呈現(xiàn)不同現(xiàn)象，當(dāng)蔗糖濃度為60 g/L時(shí)，不定根的生長(zhǎng)情況最佳，根短而粗壯，呈白色（圖3）。

表6 生根誘導(dǎo)情況統(tǒng)計(jì)

圖3 60 g/L蔗糖誘導(dǎo)的不定根

2.4 煉苗移栽

共移栽組培苗120株，存活118株，存活率為98.3%。

3 結(jié)論與討論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，誘導(dǎo)愈傷組織生長(zhǎng)的最佳蔗糖濃度為60 g/L，此濃度下愈傷組織生長(zhǎng)速度較快，生長(zhǎng)情況佳，這與付迎軍等[12]研究結(jié)論基本一致。誘導(dǎo)叢生芽生長(zhǎng)的最佳蔗糖濃度為40 g/L，此濃度下叢生芽生長(zhǎng)速度較快，叢芽數(shù)多。誘導(dǎo)不定根生長(zhǎng)的最佳蔗糖濃度為60 g/L，此濃度下根較短而粗壯，呈白色；在0～60 g/L的蔗糖濃度范圍內(nèi)，誘導(dǎo)不定根生長(zhǎng)的效果隨著蔗糖濃度的升高而增強(qiáng)，但當(dāng)蔗糖濃度再次上升后，誘導(dǎo)效果則開(kāi)始減弱，表現(xiàn)為生根誘導(dǎo)率降低，根短，有根毛。這與盧其能[13]的研究結(jié)果相似。經(jīng)煉苗移栽后，組培苗存活率高達(dá)98.3%。

蔗糖是組織培養(yǎng)中最常用的碳源。在植物組織培養(yǎng)中，糖的用量不僅影響培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)量，還影響其代謝水平、次生代謝物的合成以及細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)生。因此，建議在索邦百合離體培養(yǎng)過(guò)程中，將誘導(dǎo)生長(zhǎng)的蔗糖濃度調(diào)節(jié)至最適宜的濃度值，從而建立高質(zhì)量的索邦百合快速離體繁殖體系，為索邦百合組織培養(yǎng)的工廠化生產(chǎn)和其他后續(xù)科學(xué)研究奠定良好的基礎(chǔ)。