血清miR-216a、ANGPTL4水平與新生兒急性呼吸窘迫綜合征病情嚴重程度和預后的關系

姜梨梨，付杰，鄭愛華，劉軍

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是由肺泡表面活性劑的原發性或繼發性減少引起的一種以氣體交換異常和急性低氧性呼吸衰竭為特征的呼吸系統疾病，進展快、預后差，嚴重威脅新生兒生命安全，病死率9.6%～15.2%[1-2]。研究表明，失控性炎性反應介導的彌漫性肺泡損傷、肺通透性增加等參與ARDS發生發展[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)參與多種細胞因子轉錄調控，在炎性反應中扮演重要角色[4]。miR-216a是一種高度保守的miRNA，研究報道miR-216a能通過增加內皮細胞通透性參與急性胰腺炎并發急性肺損傷[5]。血管生成素樣蛋白4(angiopoietin like 4，ANGPTL4)是一種血管生成刺激因子，在空氣污染誘導的小鼠肺損傷中，ANGPTL4表達上調與小鼠肺部炎性反應、肺泡數量減少和肺功能損傷有關[6]。然而，關于miR-216a、ANGPTL4在人類ARDS中的臨床意義尚無研究報道，現分析ARDS新生兒血清miR-216a、ANGPTL4水平與病情嚴重程度及預后的關系，以確定miR-216a、ANGPTL4是否可以作為ARDS新生兒預后的生物標志物，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年7月—2022年3月亳州市人民醫院新生兒重癥監護室(NICU)收治的ARDS新生兒160例為ARDS組，男106例，女54例，日齡3～17(9.96±2.71)d；胎齡25～41(36.61±3.72)周；分娩方式：陰道分娩77例，剖宮產83例；出生體質量1.98～3.71(2.65±0.51)kg；ARDS病因：誤吸36例，膿毒癥61例，肺炎36例，胎糞吸入15例，其他原因12例；出生后5 min時Apgar評分：4～10[8.00(7.00,9.00)]分；機械通氣時間：1～15[7.00(5.00,9.00)]d。另選取同期健康新生兒36例為健康對照組，男23例，女13例，日齡1～20(10.03±1.98)d；分娩方式：陰道分娩20例，剖宮產16例；出生體質量2.15～4.41(2.83±0.79)kg。2組新生兒性別、日齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準(2019亳倫字0154)，受試兒家屬或監護人知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準：①符合2017年國際性多中心多學科協作組“新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒標準”[7]診斷標準；②發病(明確或可疑臨床損傷出現后)時間≤7 d。(2)排除標準：①先天性疾病；②膈疝、肺發育不良、肺腺瘤樣畸形等遺傳性缺陷；③腦性過度換氣；④惡性腫瘤；⑤嚴重肝腎功能障礙；⑥資料不全。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清miR-216a、ANGPTL4水平檢測：收集ARDS新生兒入NICU后6 h內、健康新生兒入組時股靜脈血3 ml，離心留取血清分置2份，保存于-80℃冰箱中待測。一份血清標本用于qPCR，Trizol試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)提取血清總RNA，純度、濃度合格后反轉錄試劑盒(日本TaKaRa Bio公司)逆轉錄合成cDNA，根據SYBR Green qPCR Mix試劑盒(南京歐凱生物科技有限公司)進行PCR擴增：miR-216a上游引物：5′-TAATCTCAGCTGGCAACTGTGA-3′，下游引物：5′-TCACAGTTGCCAGCTGAGATTA-3′；以U6為內參；反應條件：95℃預變性90 s、95℃變性30 s、63℃退火30 s、72℃延伸15 s，循環40次后采用2-ΔΔCT法計算血清miR-216a表達量。另一份血清標本采用ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)檢測ANGPTL4水平。

1.3.2 病情和預后分組：ARDS新生兒入NICU后首次機械通氣時計算氧指數(oxygenation index，OI)=吸入氧濃度×平均氣道壓×100/動脈血氧分壓，參考“新生兒急性呼吸窘迫綜合征蒙特勒標準”[7]將ARDS新生兒分為輕度亞組62例(OI 4～<8)、中度亞組53例(OI 8～<16)、重度亞組45例(OI≥16)。所有ARDS新生兒均參考文獻[8]接受機械通氣、高頻振蕩通氣、肺表面活性物質替代、體外膜肺氧合等治療，根據病情危重放棄治療、轉院、死亡或痊愈出院分為預后良好亞組103例和預后不良亞組57例。

2 結 果

2.1 2組血清miR-216a、ANGPTL4水平比較 ARDS組血清miR-216a水平低于健康對照組(1.95±0.32 vs.3.84±0.49)，而ANGPTL4水平高于健康對照組[472.84(201.47,743.10)μg/L vs.61.70(52.89,87.69)μg/L](t/U=21.964、9.242，P均<0.001)。

2.2 不同病情嚴重程度ARDS新生兒血清miR-216a、ANGPTL4水平比較 輕度亞組、中度亞組、重度亞組新生兒血清miR-216a水平依次降低，而ANGPTL4水平依次升高(P均<0.01)，見表1。

表1 不同病情嚴重程度ARDS新生兒血清miR-216a、ANGPTL4水平比較

2.3 ARDS新生兒血清miR-216a、ANGPTL4水平與OI的相關性 160例ARDS新生兒OI為4.23～23.50[9.91(6.60,16.49)]，Spearman相關系數分析顯示，ARDS新生兒血清miR-216a與OI水平呈負相關(rs=-0.635，P<0.001)，血清ANGPTL4水平與OI呈正相關(rs=0.693，P<0.001)。

2.4 不同預后ARDS新生兒的臨床/病理特征比較 預后不良亞組患兒胎齡、出生體質量、Apgar評分及血清miR-216a水平低于預后良好亞組，機械通氣時間、OI及血清ANGPTL4水平高于預后良好亞組(P<0.01)，2亞組患兒性別、日齡、ARDS病因、剖宮產比例比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 不同預后ARDS新生兒臨床/病理特征比較

2.5 ARDS新生兒預后不良的多因素Logistic回歸分析 以預后情況(不良為“1”，良好為“0”)為因變量，以胎齡、出生體質量、Apgar評分、機械通氣時間、OI、miR-216a、ANGPTL4為自變量，多因素Logistic回歸分析顯示，胎齡延長、Apgar評分增加及血清miR-216a 升高為ARDS新生兒預后不良的獨立保護因素，機械通氣時間延長、OI升高及血清ANGPTL4升高為其獨立危險因素(P<0.05)，見表3。

表3 ARDS新生兒預后不良的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清miR-216a、ANGPTL4水平預測ARDS新生兒預后不良的價值 繪制ROC曲線結果顯示，血清miR-216a、ANGPTL4及二者聯合預測ARDS新生兒預后不良的AUC分別為0.796、0.792、0.902，二者聯合預測價值較單獨預測高(Z=3.818、3.484，P均<0.001)，見表4、圖1。

表4 血清miR-216a、ANGPTL4水平單獨與聯合預測ARDS新生兒預后不良的價值

圖1 血清miR-216a、ANGPTL4水平單獨與聯合預測ARDS新生兒預后不良的ROC曲線

3 討 論

ARDS是臨床常見的危重癥，不同于兒童和成人的ARDS以肺容積減少，肺順應性降低，通氣/血流比值失常為主要病理特征，新生兒ARDS以廣泛性肺泡萎陷和嗜伊紅透明膜形成為主要病理特征，且新生兒ARDS具備免疫功能低下、支氣管肺發育不良易感性、肺生物學和成熟度差等差異和胎糞吸入綜合征、嗆奶、新生兒窒息、壞死性小腸結腸炎等獨特觸發因素[9]。盡管2017年世界上首次將新生兒ARDS與兒童和成人ARDS分離，并開發了獨立的“蒙特勒標準”[7]，但新生兒ARDS仍然缺乏特異性的治療方式，病死率較高[10-12]。研究表明，各種病因能直接或間接通過炎性反應損傷肺泡上皮細胞和血管內皮細胞，同時黏附于受損血管內皮的中性粒細胞能遷移至肺泡腔和肺間質，進一步促進炎性介質釋放，引起失控性炎性反應，加重肺泡損傷和肺血管通透性，惡化肺功能[3]。

miRNA是一類長度為18～25個核苷酸的小分子，通過與mRNA的3'-非翻譯區互補配對調控基因表達，在ARDS發生發展中發揮重要作用[13-15]。miR-216a定位于人染色體2p16.1，是先天和適應性免疫反應的調節劑，多項研究報道miR-216a在炎性反應相關疾病中異常表達，如Liu等[16]研究報道，miR-216a在支氣管肺炎中表達下調，能通過下調轉化生長因子β受體2抑制轉化生長因子β1信號傳導減輕脂多糖誘導的支氣管上皮細胞炎性反應。賈磊等[17]研究報道，miR-216a在表皮葡萄球菌感染致腹膜透析相關腹膜炎中表達下調，能靶向高遷移率族蛋白B1抑制腹膜炎性反應。上述研究表明，miR-216a在多種疾病中具有抗炎作用。且近年一項細胞實驗也顯示，miR-216a高表達可能通過抑制炎性反應改善肺內皮細胞通透性[5]。本研究中觀察到ARDS新生兒血清miR-216a表達下調，提示miR-216a可能參與ARDS發生。“蒙特勒標準”認為氧合指數易受呼吸機壓力參數影響，且在高頻振蕩通氣下不能有效獲得呼氣終末正壓，因此推薦使用OI量化評估新生兒ARDS嚴重程度，OI越高反映ARDS新生兒低氧血癥和呼吸窘迫癥狀越嚴重[7]。本研究結果顯示，ARDS新生兒血清miR-216a水平隨著病情加重而降低，其水平升高為ARDS新生兒預后不良的獨立保護因素，說明miR-216a水平與新生兒ARDS病情嚴重程度和預后密切相關，分析與miR-216a能通過抗炎作用抑制肺部炎性反應發展，減輕肺泡損傷和肺血管通透性有關，miR-216a水平越高肺功能越好，因此預后不良風險降低，其機制可能與miR-216a能抑制相關信號通路傳導有關。Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活子3(JAK2/STAT3)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路是參與ARDS的重要促炎信號通路[18-19]。Kong等[20]通過脂多糖誘導急性肺損傷發現，miR-216a能通過降低JAK2/STAT3和NF-κB磷酸化信號，抑制JAK2/STAT3和NF-κB信號傳導減輕肺部炎性反應損傷。

ANGPTL是一類結構與血管生成素相似的分泌蛋白家族，ANGPTL4主要由肝臟和脂肪表達，能通過抑制脂蛋白脂肪酶調節脂代謝，在代謝相關疾病中發揮重要作用[21]。近年研究發現，ANGPTL不僅參與脂代謝調節，還具有調節炎性反應和血管通透性等作用，敲低ANGPTL4通過抑制NF-κB信號通路抑制促炎細胞因子表達，上調ANGPTL4能通過增強炎性反應導致血管內皮通透性增加[22-23]。在肺損傷研究模型中發現，ANGPTL4在無菌性急性肺損傷過程中被大量激活和轉錄，參與肺部炎性反應和肺泡損傷[24]。另一項肺炎球菌性肺炎研究中，外源性給予ANGPTL4抗體治療能減輕肺炎球菌性肺炎的肺水腫和肺損傷[25]。上述研究表明，ANGPTL4在肺損傷中發揮重要作用。本研究結果顯示，ARDS新生兒血清ANGPTL4水平升高，提示ANGPTL4可能參與ARDS發生，可能與ARDS發生后ANGPTL4被激活和轉錄有關。進一步分析發現，ARDS新生兒血清ANGPTL4隨著病情加重而升高，是ARDS新生兒預后不良的獨立危險因素，說明血清ANGPTL4水平與新生兒ARDS病情嚴重程度及預后密切相關，分析與ANGPTL4能通過激活NF-κB信號通路參與肺部炎性反應和增加肺血管通透性有關。Guo等[26]通過脂多糖誘導急性肺損傷發現，沉默ANGPTL4能靶向沉默信息調節因子2相關酶1抑制NF-κB信號激活，改善肺部炎性反應和肺通透性。本研究結果還顯示，胎齡延長、Apgar評分增加為ARDS新生兒預后不良的獨立保護因素，機械通氣時間延長、OI升高為獨立危險因素，分析是胎齡越長的ARDS新生兒肺部發育更成熟，Apgar評分越高反映ARDS新生兒供氧狀況更好，因此預后更好，而機械通氣時間越長和OI越高反映ARDS新生兒病情越危重，因此預后越差。本研究ROC曲線分析顯示，血清miR-216a、ANGPTL4水平單獨預測ARDS新生兒預后不良的AUC分別為0.796、0.792，均不足0.80，而二者聯合預測ARDS新生兒預后不良的AUC增加至0.902，說明血清miR-216a、ANGPTL4水平均能作為ARDS新生兒預后不良的輔助預測指標，且聯合檢測血清miR-216a、ANGPTL4水平對ARDS新生兒預后不良的輔助預測價值更高。

綜上所述，ARDS新生兒血清miR-216a水平降低，ANGPTL4水平升高，二者與ARDS新生兒病情嚴重程度及預后密切相關，可作為ARDS新生兒預后評估的生物標志物。但本研究樣本量較少，還需多中心大樣本研究進一步證實。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

姜梨梨：設計研究方案，實施研究過程，收集整理資料，論文撰寫;付杰：課題設計，監督研究過程，進行統計學分析，論文修改；鄭愛華、劉軍：提出研究思路，分析試驗數據，論文審核