黃河源區季節性湖泊濕地退化對土壤微生物碳源利用的影響

段 鵬，姚步青，趙之重,3*，韋鎔宜，張永超，秦文萍, 王 婷

(1.青海大學，青海 西寧 810016；2.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；3.青海民族大學，青海 西寧 810007；4.青海省畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016)

季節性湖泊濕地屬于湖泊濕地的二級分類濕地，由面積較小的(1 km2)季節性積水的湖沼組成，是青藏高原高寒濕地的重要組成部分[1]，對我國的生態安全具有非常重要的保護作用[2]。但由于全球變暖與人類不合理放牧，青藏高原高寒濕地不斷發生退化[3]。高寒濕地退化是以水分流失為驅動的演替過程，其退化過程為從高寒濕地到沼澤化草甸，再到退化草甸，最后退化為“黑土灘”[4-5]。濕地退化過程中濕地面積減少，濕地呈斑塊化分離，濕地植物群落組成發生退化，土壤物理結構遭受破壞，土壤養分大量流失[6]。生境的改變會引起土壤微生物對碳源利用能力的變化[7-8]，而微生物對碳源的利用能力可以作為土壤質量和土壤肥力變化的重要指標[9]。因此研究濕地退化對土壤微生物碳源利用的影響以及土壤微生物碳源利用能力與不同環境因子的關系，對于濕地退化研究具有重要意義。

土壤微生物作為濕地土壤的重要組成部分，在維持濕地土壤生態系統的生態穩定等方面起著重要作用[10]。濕地土壤微生物是由多種類微生物組成的結構極為復雜的微生物群落[11-12]，土壤微生物碳源利用受到土壤微生物群系結構、種類、固有性質的影響[13]。土壤微生物對不同類型碳源的利用不僅會影響土壤微生物活性還會影響其功能多樣性，微生物對碳源的利用能力以及微生物功能多樣性作為關鍵性土壤微生物生態指標，可以敏感地反映出土壤質量和健康狀況[14-16]，對探索濕地退化對土壤微生物群落的影響，了解濕地生態系統結構和功能具有重要意義[17-18]。李慧等人[19]對草原的土壤微生物群落特征研究發現，不同根系微生物對碳源的利用能力有差異，該差異主要受微生物對氨基酸類和碳水化合物類碳源利用變化的影響。翁曉紅等人[20]對三江平原小葉章濕地研究發現，小葉章濕地土壤微生物對胺類碳源的相對利用率最高。段鵬等人[21]通過對高寒河流濕地退化研究發現，隨著高寒濕地的退化，其土壤微生物對碳源的利用強度下降，其中對脂類碳源的相對利用率最高，脂類碳源為優勢碳源。因此，研究季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物群落功能多樣性和微生物對各類碳源利用情況的變化，可以了解不同退化階段土壤微生物群落碳源利用的差異及其與各環境因子間的關系，為調控季節性湖泊濕地微生物群落結構和功能提供理論依據[22]。黃河源區地處中國青海省三江源自然保護區內，屬于內陸高寒濕地，其濕地資源對當地的生態環境、氣候變化、水質凈化以及下游水系水質具有重要影響[21]。但有關黃河源區季節性湖泊濕地退化對土壤微生物碳源利用的影響以及不同環境因子和土壤微生物碳源利用的關系等方面仍不明確。

Biolog微平板分析法作為一種操作簡單快捷，并能準確地獲取微生物群落碳源利用和結構與功能多樣性等相關信息的研究方法，可以分析土壤微生物對不同碳源的利用能力和土壤微生物多樣性變化規律[23-24]，已被廣泛應用于土壤生態系統研究。因此，本研究以黃河源區退化季節性湖泊濕地為研究對象，采用空間代替時間的方法，利用Biolog-Eco法研究季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物結構與功能多樣性以及土壤微生物碳源利用情況，解析季節性湖泊濕地退化對土壤微生物功能多樣性、土壤微生物群系結構和土壤微生物碳源利用的影響，以期揭示季節性湖泊濕地過程中土壤微生物群落碳源利用差異及其與各環境因子的關系，為黃河源的季節性湖泊濕地退化監測和近自然修復提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區自然概況

試驗區(33°50′～35°40′N，96°55～99°20′E)位于中國青海省三江源自然保護區內[21]，地處果洛州瑪多縣境內，屬高寒草原氣候，平均海拔4 400 m以上，晝夜溫差與年溫差較大[25]，除植被生長季以外，各月平均溫度處于0℃以下。有一條河流自北向南流過試驗區，并在試驗區內形成由湖泊濕地組成的濕地核心區[21]，核心區的湖泊濕地主要是由面積較小(<1 km2)，且在雨季能得到部分水源補充的季節性湖沼組成的。

1.2 樣點布設及采樣概況

2018年5月份，在實驗區內，采用空間代替時間的方法，根據水分梯度和植被群落變化特征，以核心區的季節性湖泊為中心向外圍出發，垂直距離湖泊濕地由近及遠，設置3條重復樣線。參考李飛[26]、李成一[27]、李希來[4]和林春英[3]等人對季節性湖泊濕地退化的劃分，從湖泊濕地中心向外圍延展將退化季節性湖泊濕地劃分為4個階段，且第4階段為非濕地景觀，并采用Gao等方法和高寒沼澤濕地退化等級標準(DB 63/T 1794-2020)中對濕地退化的劃分[21,28-29]，結合本實驗樣地的實際地形及環境狀況，每條重復線上設立4個退化樣點，將季節性湖泊濕地退化人為分為未退化濕地(濕地)、輕度退化濕地(沼澤化草甸)、中度退化濕地(退化草甸)、重度退化濕(退化草原)。

2018年8月份對所劃分的季節性湖泊濕地不同退化階段，采用0.5 m×0.5 m樣方框進行植被群落取樣，測定植被高度、蓋度和生物量，并進行三次重復測量。測定土壤濕度并使用土鉆(直徑5 cm)采樣不同退化階段0～10 cm土層的土壤，每個退化階段區域內隨機選取5個采樣點進行采樣，每個樣點隨機采集3鉆土壤[21]，并將3鉆土合并為一個土壤樣品[21]，去除植被根系和碎石，土壤樣品及時送回實驗室4℃保存。

1.3 試驗方法

1.3.1植被處理 采用目測法對每個樣方框內的植被進行覆蓋度測定，將樣方框內植被地上部分齊根剪下，使用烘干箱進行烘干處理(65℃，48 h)，計算植被地上生物量[21]。使用根鉆采集0～10 cm土層中的植被根系，去除雜草、泥土和碎石等，清洗烘干(65℃，48 h)，計算植被地下生物量。

1.3.2土壤處理 運用重鉻酸鉀-內稀釋熱法對土壤有機碳測定，使用流動注射分析儀(SEAL Auto Analys-er 3，德國)對土壤全氮、全磷含量進行測定，采用Top Cloud-agri WET速測儀對土壤含水量和電導率進行測定[21]。

1.3.3土壤微生物功能多樣性測定 Biolog微平板分析法作為一種研究微生物群落功能多樣性的常用方法，其主要通過分析土壤微生物對各類碳源的代謝功能，進而獲得土壤微生物群落對碳源的代謝能力等相關數據[30]，Biolog-Eco微平板為標準的96孔板，板內包含3組重復，每組中包含31個含有不同單一碳源的培養基孔和1個空白對照孔[21]。土壤微生物功能多樣性測定的具體實驗過程：稱取10 g鮮土和90 mL 0.85%無菌NaCl溶液倒入錐形瓶中，150 r·min-1條件下震蕩30 min，后靜置20 min。用移液槍吸取150 μL的釋至10-3的土壤懸浮液接種到Biolog-Eco板中[29]，置于25℃恒溫培養箱連續培養240 h，并使用酶標儀在590 nm條件下每24 h測定各孔吸光值[21]。

1.4 數據處理

公式計算如下[21,31]：

AWCD=[∑(C-R)]÷N

(1)

公式中AWCD為土壤微生物平均顏色變化率(Average well color development)，C為單一碳源孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，N為所分析的碳源數量[21,32]。

(2)

公式中U為土壤微生物Mclntosh指數，ni為第i孔的相對吸光值[21]。

H′=-∑PilnPi

(3)

公式中H′為土壤微生物Shannon-wiener物種豐富度指數，Pi為第i個孔的相對吸光值/所有孔的相對吸光值之和[21]。

碳源相對利用率=恒溫培養168 h下的某一類型碳源AWCD之和/31種碳源的AWCD值之和×100%。Biolog生態板中的31種碳源根據其化學基團的性質的不同大體分為六大類：單糖/糖苷/聚合物類、醇類、氨基酸類、酯類、胺類和酸類[33]。

樣地基本數據采用Excel進行數據分析，采用SigmaPlot分析成圖，采用Origin進行主成分和冗余分析，運用SPSS進行單因素方差分析(One-way ANOVA)[21]，利用Pearson進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同退化階段植被及土壤特征

季節性湖泊濕地退化過程中植被基礎數據見表1，隨季節性湖泊濕地退化加重，其植被蓋度、地上生物量和地下生物量顯著下降(P<0.05)。重度退化濕地與未退化濕地相比，植被蓋度下降了33.33%，地上生物量下降了82.82%，地下生物量下降了85.16%。

表1 不同退化階段植被基本群落特征的變化

季節性湖泊濕地退化過程中土壤基本理化性質見表2，季節性湖泊濕地退化過程中，其土壤全氮、全磷含量和含水量均呈先升高后下降趨勢，且變化顯著(P<0.05)，而土壤電導率顯著降低(P<0.05)。重度退化濕地與未退化濕地相比，土壤全氮含量下降了45.61%、全磷下降了15.00%、有機碳含量下降了23.29%，含水量下降了42.23%。

表2 不同退化階段土壤理化性質變化

2.2 不同退化階段土壤微生物群落碳源利用總體特征

土壤微生物群落AWCD值可以反映土壤微生物群落的活性和土壤微生物群落的碳源利用強度[34-36]。季節性湖泊濕地不同退化階段的AWCD值如圖1所示。由圖1A可知，在培養過程中，0～24 h土壤微生物AWCD值變化較小，24～96 h土壤微生物AWCD值迅速增長，168 h后土壤微生物的AWCD值逐漸穩定。因此本研究通過對168 h培養時間下季節性湖泊濕地各退化階段的AWCD值進行分析。由圖1B可知，隨季節性湖泊濕地退化，土壤微生物活性呈先升高后下降趨勢，其中輕度退化濕地AWCD值顯著高于其他退化階段(P<0.05)，而重度退化濕地AWCD值顯著低于其他退化階段(P<0.05)。

2.3 不同退化階段土壤土壤微生物多樣性特征

本研究采用Mclntosh指數、Shannon指數反映季節性湖泊濕地退化過程中土壤微生物均勻度和豐富度的變化[8,37]，168 h培養時間下，季節性湖泊濕地不同退化階段的土壤微生物均勻度和豐富度的分析結果如圖2所示。由圖2A可知，季節性湖泊濕地各退化階段土壤微生物均勻度從24 h培養時間開始，隨培養時間的增長而不斷提高，到168 h增長減緩趨于平穩。由圖2B可知，輕度退化濕地土壤微生物均勻度顯著高于重度退化濕地(P<0.05)，隨季節性湖泊濕地退化加重，其土壤微生物均勻度整體上呈現先升高后下降趨勢。由圖2C可知，季節性湖泊濕地土壤微生物豐富度隨培養時間增長無明顯變化。由圖2D可知，輕度退化濕地土壤微生物豐富度顯著高于重度退化濕地(P<0.05)，隨季節性湖泊濕地退化加重，其土壤微生物豐富度整體上呈現先升高后下降趨勢。

圖2 季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物群落功能多樣性

2.4 不同退化階土壤微生物對不同類型碳源利用特征

選取AWCD值趨于平穩的168 h培養時間下的季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物對不同碳源的利用能力進行分析，如表3所示，季節性湖泊濕地退化使土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類、酯類、醇類、胺類碳源的相對利用率先增加后減少，重度退化濕地與未退化濕地相比，土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用率下降了93.33%，酯類下降20.00%，醇類下降42.71%，胺類下降36.59%。其中土壤微生物對酯類碳源的相對利用率始終高于其它碳源，土壤微生物對酸類碳源的相對利用率隨退化的加重而增長，重度退化濕地微生物對酸類類碳源的相對利用率與未退化濕地相比增加了32.69%。隨季節性湖泊濕地退化的加重，土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用率變化趨勢與土壤生物群落碳源利用總體特征的變化趨勢相似，均呈現先升高后下降趨勢。

表3 季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物對各類碳源的利用情況

2.5 退化濕地土壤微生物群落主成分分析

選取AWCD值趨于平穩的168 h培養時間下季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物對不同碳源的利用率進行主成分分析，提取了2個主成分，第一主成分(PC1)為51.5%，第二主成分(PC2)為23.9%，選取第一、二主成分作圖來表征不同退化階段土壤微生物對六大類碳源的利用狀況，各退化階段之間距離大小可以表示其土壤微生物對六大碳源的利用狀況的相似度，距離越小其利用狀況的相似度越高。如圖3所示，未退化階段和輕度退化階段分布在一個區域，離散性較小，中度退化階段和重度退化階段分布在一個區域，離散性較小，但兩組間分布在不同區域，離散性較大，表明未退化濕地和輕度退化濕地土壤微生物對碳源的利用狀況相近，中度退化濕地和重度退化濕地土壤微生物對碳源的利用狀況相近，但未退化濕地和輕度退化濕地與中度退化濕地和重度退化濕地土壤微生物對碳源的利用狀況差距較大。

圖3 不同退化階段土壤微生物對不同碳源利用主成分分析

2.6 退化濕地土壤微生物對碳源利用與環境因子之間的冗余分析

為進一步了解不同退化階段土壤微生物群落對各類碳源的利用情況與環境因子的關系，本研究對土壤微生物AWCD和其相應的基本植被與土壤理化數據進行冗余分析。首先對各環境因子進行了方差膨脹因子分析(表4)，分析結果表明各環境因子之間具有較高的相關性，根據分析結果剔除方差膨脹因子較高的土壤含水量、植被地上生物量和地下生物量等環境因子。重新進行共線性檢測，共線性檢測結果見表5，各環境因子的方差膨脹因子小于10，平均方差膨脹因子小于5。已有研究表明，膨脹因子大于10的環境因子不進入RDA分析[38-39]，因此土壤含水量、植被地上生物量和地下生物量環境因子不進入冗余分析。分析結果如圖4所示，1軸和2軸的解釋變量特征值分別為83.09%和11.74%，說明季節性湖泊濕地退化過程中的基礎土壤和植被指標對土壤微生物碳源利用類型影響較大。土壤全氮含量和植被蓋度與土壤微生物對糖類和醇類碳源的利用率呈顯著正相關關系(P<0.05)。但根據土壤微生物對各類碳源的利用情況與環境因子之間的相關系分析可知(表6)，土壤含水量與糖類、酯類、醇類和胺類碳源的利用有顯著相關性。通過各環境因子之間的相關性分析可知(表7)，含水量與全氮含量、全磷含量、電導率和植被蓋度顯著正相關。

表4 多重共線性檢驗結果

表5 多重共線性檢驗結果

表6 環境因子之間的相關性

表7 土壤微生物對各類碳源的利用情況與環境因子之間的相關系分析

圖4 不同退化階段土壤微生物對碳源利用和環境因子的冗余分析

2.7 退化濕地土壤微生物群落特征與環境因子之間的相關性分析

黃河源區季節性湖泊濕地退化過程中各環境因子對土壤微生物功能多樣性的影響見表8，土壤全氮含量、土壤含水量和植物蓋度與土壤微生物AWCD值和土壤微生物均勻度呈顯著正相關關系(P<0.05)，土壤全氮、全磷含量和土壤含水量與土壤微生物豐富度呈顯著正相關關系(P<0.05)。

表8 平均顏色變化率、均勻度、豐富度與環境因子之間的相關性分析

2.8 退化濕地土壤微生物群落特征與其對碳源利用情況相關性分析

黃河源區季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物利用各類碳源的能力對其功能多樣性的影響見表9，在季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類和醇類碳源的利用與土壤微生物AWCD值、土壤微生物均勻度和土壤微生物豐富度顯著正相關(P<0.05)。且土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的利用與土壤微生物功能多樣性具有極顯著的相關性(P<0.01)。即不同退化階段微生物功能多樣性差異主要體現在對單糖/糖苷/聚合物類碳源和醇類碳源的利用上，其中土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的利用能力尤為突出。

表9 平均顏色變化率、均勻度、豐富度與土壤微生物對碳源利用之間的相關性分析

2.9 不同退化階段土壤微生物代謝指紋數據聚類分析

1991年，代謝指紋技術首次被應用于微生物群落分析，微生物代謝指紋可以通過分析土壤微生物群系的特性，有效地區分不同退化程度的土壤微生物群系在時間和空間的變化以及相似度的關系。聚類分析圖譜可以直觀顯示出各退化階段土壤微生物對不同種類碳源的利用情況，并將利用狀況相似的樣點聚為一類[8]。

由于168 h培養時間下微生物AWCD值趨于平穩，因此將接種土壤懸液的Biolog-Eco板168 h培養時間下的數值做聚類分析，并形成樹狀圖。由圖5可知，當聚合水平大于10時將季節性湖泊濕地不同退化程度的土壤分為兩類。第一類包括未退化濕地、輕度退化濕地和中度退化濕地，第二類包括重度退化濕地。重度退化濕地與未退化濕地、輕度退化濕地和中度退化濕地較長的距離尺度相聚，說明重度退化濕地微生物群系結構與其他退化階段相比產生明顯改變。

圖5 季節性湖泊濕地不同退化階段土壤微生物群系代謝指紋聚類分析圖譜

3 討論

本研究發現，在黃河源區季節性湖泊濕地退化過程中，隨著植被蓋度、生物量、土壤全氮含量、全磷含量、有機碳含量和含水量的顯著下降(P<0.05)，土壤微生物對碳源利用的強度以及微生物群落功能多樣性發生改變，其土壤微生物對碳源的利用能力以及活性整體呈下降趨勢。這與劉燕等[32]對黃河源區黑土灘退化的研究結果相近，說明濕地退化過程中土壤微生物對碳源的利用能力等特征受多環境因子的影響。對濕地不同退化階段的土壤微生物對碳源的利用能力與環境因子相關性分析可知，植被蓋度和土壤含水量與土壤微生物對碳源的利用能力呈顯著正相關關系，其主要原因是植被蓋度下降導致土壤呼吸增強、土壤含水量下降[40]，從而影響土壤微生物的碳源代謝[41]。已有文獻表明，土壤水分下降，土壤物理結構受到破壞，在風蝕的影響下土壤大團聚體被破壞，大量有機碳流失與分解[42-44]，土壤有機碳作為土壤微生物可利用的碳源[45]，其流失影響土壤微生物對碳源的利用。李飛等[26]對土壤微生物碳代謝功能多樣性影響的研究中也發現濕地全氮含量、全氮/全磷、含水量和植被蓋度可以顯著影響微生物活性和其碳源代謝。已有研究表明，土壤微生物的豐富度受到土壤養分、含水量、容重和植物蓋度等因素的影響[46]，但本研究發現黃河源區季節性湖泊濕地退化過程中，植被蓋度對其土壤微生物豐富度沒有顯著影響，這可能是由于植被類型和數量的不同導致的，微生物群落豐富度受植被群落物種和數量的共同影響[47]，因此退化高寒濕地植被群落結構對微生物功能多樣性的影響有待進一步研究。

由主成分分析結果可看出，不同退化階段的土壤微生物在對各類碳源的利用上出現明顯差異，可見濕地退化改變了土壤微生物群落對碳源的代謝能力(圖3)。季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物對酯類碳源的相對利用率最高，酯類碳源為優勢碳源，土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源利用率的變化與土壤微生物活性的變化相似，均呈現先升高后下降趨勢。糖類碳源極易被微生物同化，可以形成碳源比較豐富的環境[48]，說明季節性湖泊濕地退化抑制了土壤中的糖類形成，不利于微生物生長繁殖，從而降低了土壤微生物活性及多樣性。土壤微生物對酸類碳源的相對利用率隨季節性湖泊濕地退化的加劇而增長，引起此變化的原因可能是在未退化階段土壤中存在某些土壤微生物可以代謝產生酸類物質，其代謝產生的酸類物質可以供微生物利用[49]，但隨著季節性湖泊濕地退化該類微生物數量減少，因此土壤微生物對酸類碳源的相對利用率增加。本研究根據環境因子的共線性檢測結果，在環境因子和土壤微生物利用各類碳源的能力的冗余分析中去除了土壤含水量、植被地上生物量和地下生物量等環境因子。但根據環境因子間相關性分析和土壤微生物對各類碳源的利用情況與環境因子之間的相關系分析結果，本研究推測土壤含水量可能是通過影響全氮含量、全磷含量、電導率和植被蓋度等環境因子進而對土壤微生物碳源的利用產生影響。

環境因子與微生物碳源利用的冗余分析結果與土壤微生物AWCD，U，H′值與環境因子之間的相關性分析結果對比可知，土壤全氮含量和植被蓋度對土壤微生物利用各類碳源的能力具有顯著性影響(P<0.05)，其中土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用率受各環境因子影響最大，并且影響土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用率的環境因子與影響土壤微生物活性的環境因子相同。而姚玉嬌等人[50]通過對高寒草甸退化研究發現，其土壤微生物對碳源的利用主要受土壤有機質含量和電導率等影響。通過對AWCD，U，H′與土壤微生物利用不同碳源能力之間的相關性分析發現，在季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物群落代謝功能多樣性變化主要受土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源和醇類利用率變化的影響。而劉燕等人[33]對退化草地的土壤微生物群落特征研究發現，隨著退化加劇，微生物對不同碳源的利用產生差異，差異主要表現在對酸類、氨基酸類和酯類的利用。金裕華等人[51]通過對不同海拔的武夷山研究發現，武夷山不同海拔高度土壤微生物群落對各種碳源的利用度有所不同。因此，推斷不同生態系統由于其生境的不同，導致其土壤微生物群系結構不同，從而使土壤微生物對各類碳源的利用能力產生差異，影響了微生物群落功能多樣性。本研究推測各環境因子主要通過影響土壤微生物對單糖/糖苷/聚合物類碳源的利用，進而影響土壤微生物活性。本研究中選取的環境因子為基礎的植被群落特征指標和土壤理化指標，因此，未來還需增加環境因子的類型，并結合高通量測序技術、宏基因組技術等多技術手段深入探討季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物對碳源的利用與土壤微生物群落結構的關系，從而進一步揭示季節性湖泊濕地退化過程中各環境因子對土壤微生物碳源利用的影響。

4 結論

在黃河源區季節性湖泊濕地退化過程中，土壤微生物對碳源的利用存在明顯的空間分異，土壤微生物對酯類碳源的相對利用率始終最高，對酸類碳源的相對利用率呈增長趨勢，對單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用率變化與土壤微生物碳源代謝強度和功能多樣性變化相似，均呈現先升高后下降趨勢。不同退化階段土壤微生物功能多樣性的差異主要受微生物對單糖/糖苷/聚合物類和醇類碳源的相對利用率變化的影響。土壤全氮含量、含水量和植被蓋度對微生物單糖/糖苷/聚合物類碳源的相對利用和土壤微生物活性均有顯著影響。