2,4-表油菜素內酯對甜高粱和青貯玉米幼苗耐澇性的影響

蘇 杭, 翟建榮, 鄧苛莉, 栗 揚, 楊建峰, 綦 才, 郭彥軍

(1.西南大學動物科學技術學院，重慶 400716；2.青島農業大學草業學院，山東 青島266109；3.西南大學農學與生物科技學院，重慶 400716)

甜高粱(SorghumsaccharatumMoench)與青貯玉米(Zeamays)是生產中使用較為廣泛的C4禾本科(Gramineae)飼草作物，具有產量高、品質良、適口性好、種植地區廣的特點[1-2]。然而，春播時作物將面臨干旱問題，而夏播時(6月中下旬)，遇到短時間強降雨極易遭受澇害的影響,造成產量和品質的下降[3]。在水澇脅迫下，隨著脅迫時間的延長，水中可溶性氧被消耗完，植物的根系處于低氧或缺氧環境中，有氧呼吸轉換為無氧呼吸，產生酒精、乙酸等物質，對植物產生毒害作用[4]，使細胞氣孔關閉、胞間CO2濃度和植物光合速率下降，最終導致植物產量下降[5]。為了盡早適應淹水脅迫，植物可通過改變根系形態，調節理化指標來提高缺氧條件下的生存能力，如促進植株偏上性和偏下性生長、不定根、通氣組織的形成[6]。此外，在水澇脅迫下，細胞內自由基的產生和清除之間的平衡遭到破壞，大量O2-積累使丙二醛(Malonyldialdehyde，MDA)含量增加。植物為了緩解水澇脅迫對它的毒害作用，體內抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(Aseorbateperoxidase，APX)活性增強，提高了清除活性氧自由基的能力，使膜脂過氧化降低，減少了相關代謝產物如MDA的積累。淹水脅迫下，植物體內游離脯氨酸含量的積累也被認為是植物對缺氧脅迫的生理適應[7]。一般情況下，短期水澇對植物造成的傷害較小；長期水澇導致根部厭氧呼吸產生大量乙醇、乙醛等物質，對細胞產生毒性。因此，如何提高植物苗期的抗澇性已成為生產中亟待解決的實際問題。

種子引發是指控制種子緩慢吸水，使種子進入萌動但胚根不突破種皮的階段，然后再使種子緩慢回干的種子處理技術[8]。種子引發處理可以打破種子休眠，提升發芽速率和發芽率，促進幼苗生長[9]。種子引發還能提升種子在低溫、澇害、干旱、鹽堿等非生物脅迫環境中的抗逆性[10]。根據引發劑中溶質的不同可分為無機鹽溶液引發、激素引發、營養引發等。2,4-表油菜內酯(2,4-epibrassionolide，EBR)是一種內源性多羥基甾體植物激素，在植物生長發育和逆境適應過程中有重要的作用[11]。EBR增強植物抗逆性的機制可能與其可以激活細胞合成自由基清除酶的能力有關。雷新慧等[12]的研究表明，使用0.1 μmol·L-1的EBR浸種12 h，顯著增加蕎麥(Fagopyrumesculentum)種子和幼苗葉片中SOD，POD，CAT活性，降低MDA含量，促進鹽脅迫條件下蕎麥種子發芽及幼苗生長。低氧脅迫下外源EBR處理顯著提高了黃瓜(Cucumissativus)幼苗SOD和APX活性，降低了O2-，H2O2及MDA含量，增強了植株抗低氧脅迫的能力[13]。EBR通過調節大豆(Glycinemax)植株的滲透性和關鍵酶活性調節大豆的耐鹽機制，緩解鹽脅迫帶來的傷[14]。然而，用EBR引發種子是否可以提高作物耐澇性，目前尚無相關研究報道。鑒于此，本試驗用EBR引發甜高粱和青貯玉米種子，然后在苗期不同發育時期(一葉期、三葉期和五葉期)進行淹水處理，測定植物株高、干重、生物量、丙二醛和脯氨酸含量、抗氧化酶活性等，旨在揭示種子引發提高作物抗澇性的理化作用機制，為合理利用種子引發提高作物耐澇性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水淹試驗中所用的青貯玉米種子來源于云南曲辰種業有限公司，品種為‘曲辰11’，為高淀粉玉米；甜高粱種子來源于北京克沃集團，品種為‘牧樂8 000’，是美國培育的高產甜高粱品種。

1.2 試驗設計

選擇大小均勻、籽粒飽滿的種子(約2 000粒)，分別用0，0.001，0.01，0.1，1和10 μmol·L-1的2，4-表油菜素內酯(EBR)浸泡24 h。浸泡結束后取出，用蒸餾水將種子沖洗干凈，用吸水紙擦去種子表面水分后在室溫條件下自然風干，每12 h稱重一次，直至種子重量回到引發前的原始重量備用(種子重量回到引發前的原始重量后將風干過程中萌發的種子棄掉)。其中0 μmol·L-1EBR為水引發處理，未浸泡種子為對照處理。

種子萌發試驗在光照培養箱(RXZ-500A)進行。培養皿(12 cm×2.5 cm)底部鋪設兩層吸水濾紙，然后將種子整齊擺放于培養皿內，每個培養皿擺放甜高粱種子30粒，青貯玉米25粒。培養皿傾斜，防止培養皿中的水沒過種子，置于培養箱中進行發芽。每個處理設置4次重復。環境條件為光照強度為10 000 lx，光/暗培養分別為12 h/12 h，溫度25℃/20℃晝夜交替，相對濕度為85%。每日觀察記錄種子發芽情況，一周后將萌發的幼苗取出進行發芽指標的測量。

種子在室溫條件下于培養皿(底部鋪設濾紙)保濕催芽24 h，露白后播種于花盆(15 cm × 15 cm)中。每盆裝土4 kg(中性黃壤)，播種5粒。待植物生長至一葉期、三葉期、五葉期，分別開始進行淹水處理。淹水時，將花盆至于裝水培養盤(30 cm高)中，保持水面高于土壤表面2 cm，每日補水兩次。對照組土壤保持田間持水量的75%。于每日的上午7點和下午7點進行補水。每處理設置3次重復。待連續淹水10 d后，測株高。

1.3 測定內容與方法

1.3.1發芽指標測定 每天記錄發芽(胚根達種子長度、胚芽鞘達1/2種子長度)種子數，并在種子萌發第7 d，計算發芽率(發芽種子數占總種子數的百分比)；以發芽第3 d的發芽率作為發芽勢。在種子萌發第7 d，隨機選取10株幼苗，用千分尺測量其胚根長度和胚芽長度，幼苗于105℃殺青20 min,并在70℃條件下烘干至恒重。

1.3.2形態指標 盆栽試驗在淹水10 d后，用卷尺測量株高，每盆測量5株，求取平均值。將各盆植株整株取出后用自來水沖洗干凈，然后放入烘箱中，105℃殺青后，于70℃烘干至恒重(約48 h)。

1.3.3理化指標測定 淹水10 d后，采集植株完全展開的第2片葉(從植株頂端由上往下)進行理化指標的測定。游離脯氨酸含量采用酸性茚三酮法[15]測定，丙二醛(MDA)含量(以鮮質量計)采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定[16]；超氧化物歧化酶(SOD)活性(以鮮質量計)參照Rawat等[17]的方法測定；過氧化物酶(POD)活性采用木酚法測定[18]；過氧化氫酶(CAT)活性采用過氧化氫法測定[19]；抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性測定參考Amorati[20]的方法。

1.4 數據處理

使用Microsoft Excel 2010整理數據、GraphPad Prism 9作圖，采用SPSS 23.0 進行方差分析，Duncan方法檢驗各處理水平在P<0.05水平的差異性。

2 結果與分析

2.1 EBR引發對種子萌發特性的影響

2,4-表油菜素內酯(EBR)引發種子顯著影響了甜高粱和青貯玉米的種子萌發性能(表1)。隨著EBR濃度從0.001 μmol·L-1增加到0.01 μmol·L-1，兩個品種胚根和胚芽長度顯著增加(P<0.05)，但之后隨著EBR濃度的上升，胚根、胚芽長度呈下降趨勢。當EBR濃度達到10 μmol·L-1時，除甜高粱胚根長度與對照無顯著差異外，兩個品種的胚芽長及玉米胚根長仍大于對照(P<0.05)。引發對胚根干重整體無顯著影響，而EBR濃度1 μmol·L-1時，甜高粱胚根干重顯著低于其它處理(P<0.05)，而玉米胚根干重顯著高于其它處理(P<0.05)。胚芽干重在低濃度EBR(0.01和0.1 μmol·L-1)時顯著高于對照及其它處理(P<0.05)。引發對種子發芽率無顯著影響，提高了種子發芽勢，且EBR濃度為0.01 μmol·L-1時玉米的發芽勢均顯著高于其它處理(P<0.05)。相較于EBR引發，水引發也能促進種子萌發，但其整體效果不如0.01 μmol·L-1EBR。

表1 2,4-表油菜素內酯引發對甜高粱和玉米種子萌發特性的影響

2.2 水澇脅迫下種子引發對甜高粱與玉米生長發育的影響

甜高粱和玉米的株高、干重均受淹水處理、種子引發、發育時期及它們交互作用的顯著影響(表2)。淹水后，兩種作物在三個時期均表現為株高和干重顯著下降(圖1)。在未引發對照中，一葉期、三葉期和五葉期，甜高粱淹水后的株高較未淹水處理分別下降24.39%，35.16%和19.21%，干重下降14.96%，5.94%和16.91%；玉米株高下降27.35%，18.24%和13.95%，干重下降47.47%，53.33%和32.33%。EBR引發種子后，兩種作物均表現為株高及干重顯著上升(P<0.05)，且EBR引發效果顯著好于水。整體上，EBR引發種子后，兩種作物在一葉期和三葉期均表現為水澇條件下株高和干重增加幅度高于正常水分條件下株高和干重的增加幅度。對于甜高粱而言，與未引發對照比較，一葉期、三葉期和五葉期，正常水分條件下EBR引發使甜高粱株高分別增加18.29%，20.31%和13.91%，而水淹條件下分別增加29.03%，27.71%和13.93%。對于玉米而言，一葉期、三葉期和五葉期，正常水分條件下EBR引發使甜高粱株高分別增加25.64，29.05%和16.89%，而水淹條件下分別增加32.94%，41.32%和16.89%。

圖1 種子引發對淹水脅迫下甜高粱(A,B)和青貯玉米(C,D)株高和干重的影響

表2 種子引發影響水澇脅迫下甜高粱和玉米理化指標的方差分析(F值)

2.3 水澇脅迫下種子引發對甜高粱和玉米中脯氨酸和丙二醛含量的影響

淹水后，甜高粱和玉米葉中的脯氨酸含量和丙二醛含量均上升(圖2)。而EBR引發種子后，葉片中游離脯氨酸含量較未引發對照增加幅度呈上升趨勢。如在淹水條件下，玉米一葉期、三葉期和五葉期未引發對照較正常水分條件分別增加52.43%，11.53%和42.71%，而EBR引發處理分別增加94.98%，95.78%和101.45%；甜高粱未引發對照分別增加63.99%，29.08%和18.30%，而EBR引發分別增加84.38%，66.33%和80.69%。

圖2 引發對淹水脅迫下甜高粱(A,B)和玉米(C,D)苗期脯氨酸和丙二醛含量的影響

與未引發對照比較，引發處理降低了淹水條件下甜高粱和玉米葉中的MDA含量。如玉米中，一葉期、三葉期和五葉期未引發對照MDA含量淹水后分別增加201.55%，288.67%和323.93%，而EBR引發處理后分別增加143.87%，184.26%和159.00%。在甜高粱中，一葉期、三葉期和五葉期未引發對照MDA含量淹水后分別增加294.25%，197.82%和372.51%，而EBR引發后分別增加93.92%，107.27%和150.85%。

水引發處理與未引發對照相比也提高了淹水脅迫下植株體內的脯氨酸含量，降低了MDA含量的增加幅度，但其效果整體低于EBR引發處理。

2.4 水澇脅迫下種子引發對甜高粱和玉米抗氧化酶活性的影響

淹水后，不同時期玉米和甜高粱葉片中的SOD，POD，APX，CAT活性均呈上升趨勢(圖3)。與未引發相比，EBR引發相對增加了淹水脅迫下植物體內各氧化酶活性，而在正常水分條件下葉片抗氧化酶活性整體無顯著變化。對甜高粱而言，水澇脅迫條件下EBR引發植株各氧化酶活性的增幅整體上大于水引發植株各氧化酶活性的增幅。對玉米而言，在水澇脅迫下EBR引發植株的SOD，CAT酶活性顯著高于水引發植株，APX活性在水引發和EBR引發間無顯著差異，五葉期EBR引發植株POD活性顯著高于水引發處理。

圖3 種子引發對淹水脅迫下甜高粱(A，B，C，D)和青貯玉米(E，F，G，H)抗氧化酶活性的影響

3 討論

種子引發是一種低成本、有效的生理生化過程，能刺激種子萌發，改善植物在非生物脅迫下的生長發育[21]。本試驗中，EBR引發種子后，胚芽、胚根長度顯著提高，說明引發時EBR透過種皮，進入種子，繼而影響了種子的早期萌發。但EBR的引發效果與引發濃度直接相關，當EBR濃度為0.01 μmol·L-1時，甜高粱和玉米的胚芽和胚根長均顯著高于其它濃度水平，且在高濃度時(10 μmol·L-1)最低。于此同時，EBR濃度為0.01 μmol·L-1時，胚根干重與對照無顯著差異，甜高粱胚芽干重仍然是所有濃度處理中最高的。說明引發在促進胚根伸長的同時，使胚根變細。本試驗中，EBR引發未顯著增加兩個品種的種子發芽率，但0.01 μmol·L-1的EBR使種子發芽勢顯著提高。這與多數研究研究一致，即引發對發芽率的改善效果低于發芽勢[22]。發芽勢提高有利于田間整齊發芽，便于苗期田間管理，提高生產力[23]。整體而言，0.01 μmol·L-1的EBR引發種子，對甜高粱和青貯玉米的發芽勢及胚芽、胚根長發育有較為顯著的影響。

當植物遭受水澇脅迫時，缺氧環境將影響根系的有氧呼吸與養分吸收[24]，最終影響生長發育。本試驗中，兩種作物在三個時期均表現為株高和干重顯著下降，其中甜高粱干重下降幅度(平均26.25%)小于玉米干重下降幅度(43.82%)。說明淹水脅迫對兩種作物的影響不同，其中玉米較甜高粱對淹水敏感。在壩地玉米、甜高粱耐淹試驗中，在同等淹水條件下，玉米受害程度較重，甜高粱受害程度較輕，即甜高粱的耐淹性能優于玉米[25]。這與本試驗在苗期的研究結果一致。因此，在作物生長期存在淹水風險的地區，可優先考慮種植甜高粱。

EBR引發種子后，兩種作物在一葉期和三葉期均表現為水澇條件下株高和干重增加幅度高于正常水分條件。這說明引發提高了兩種作物對淹水脅迫的適應能力。種子經EBR引發后，苗期進行水澇處理時植株體內相關的抗氧化酶(POD，SOD，APX，CAT)活性較未引發處理顯著增加。這種變化將清除體內因無氧呼吸產生的大量自由基[26]，使MDA的含量下降，減輕淹水脅迫對植物細胞膜的損害。同時，本試驗中，EBR引發后植株體內游離脯氨酸含量上升，說明引發處理通過增加脯氨酸積累提高細胞的滲透壓。耐缺氧品種‘綠巴春4號’和缺氧敏感品種‘中農8號’的幼苗在添加或不添加EBR的常氧或缺氧營養液中水培8 d，EBR處理顯著提高了缺氧脅迫下的幼苗生長和SOD，APX等抗氧化酶的含量[27]，這和本試驗的研究結果一致。因此，EBR引發甜高粱和玉米種子，可在苗期淹水脅迫時，提高抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化，同時合成較多的滲透調節物質(脯氨酸)，以維持穩定的細胞滲透壓。EBR種子引發的甜高粱與青貯玉米比較，淹水脅迫后，甜高粱MDA含量增加幅度(三個時期分別為66%，120%和93%)低于青貯玉米(分別為143%，147%和140%)，脯氨酸含量增加幅度也表現出相似趨勢，說明EBR種子引發的甜高粱在淹水后受到的脅迫較玉米輕。這與青貯玉米淹水脅迫后干重下降幅度較甜高粱大的結果一致。

4 結論

0.01 μmol·L-1的EBR引發種子可提高甜高粱與青貯玉米的發芽勢，增加淹水脅迫下植株體內的抗氧化酶活性，降低膜脂過氧化水平，同時合成較多的滲透調節物質如脯氨酸，適應淹水脅迫，最終提高株高和干重。EBR種子引發后，甜高粱在淹水脅迫后積累的丙二醛和脯氨酸少于青貯玉米，干重下降幅度也低于青貯玉米，說明甜高粱苗期耐澇性強于青貯玉米。在生產中，建議選用0.01 μmol·L-1的EBR引發甜高粱和青貯玉米種子，提高植物的耐澇性。