復方非交聯透明質酸不同給藥模式對小鼠皮膚的作用和機制探討

畢雪嬋，謝孟諺，吳 艷

（北京大學第一醫院皮膚性病科 國家皮膚與免疫疾病臨床醫學研究中心 皮膚病分子診斷北京市重點實驗室 國家藥品監督管理局化妝品質量控制與評價重點實驗室 北京 100034）

透明質酸（Hyaluronic acid，HA）是一種大分子糖胺聚糖，是皮膚細胞外基質重要的組成部分，能結合多達其自身重量1 000倍的水，以提高皮膚水合和增加皮膚體積[1]。但隨著年齡增加，透明質酸等細胞外基質量逐漸減少，導致皮膚水合度下降、萎縮，皮膚干燥、出現皺紋等老化表現[2]。近來透明質酸被廣泛應用于化妝品和醫療美容行業，已有許多臨床試驗證明，滾針后涂抹或注射非交聯透明質酸具有年輕化的效果，可以減輕皺紋，改善皮膚顏色、彈性、光澤度、粗糙度等，不同給藥方式的臨床改善效果也不同[3-5]，但透明質酸不同給藥方式的具體作用機制不清。本試驗擬研究復方非交聯透明質酸（Compound non-cross-linked hyaluronic acid，CNCLHA）通過注射和滾針后涂抹等不同給藥方式對小鼠皮膚的作用，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 試驗動物及藥物：健康的C57BL/6小鼠21只，雌性，6～8周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證批號SCXK(京)2015-0001。小鼠于清潔級動物飼養室內飼養，被喂食標準飲食，購入后適應環境1周后開始試驗。復方非交聯透明質酸試劑為潤維他化妝品有限公司的絲麗動能素Cytocare 516，批號：國妝備進字J20174673。

1.2 實驗方法：本動物實驗方案經北京大學第一醫院實驗動物倫理委員會批準。將小鼠隨機分為A、B、C三組，每組7只，每組小鼠左右側皮膚接受不同處理，共6個處理組，分別為：CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組，0.9%生理鹽水滾針涂抹組，0.9%生理鹽水注射組，空白對照組。每組具體處理方法如表1所示。

表1 各組具體處理方法

在實驗前、第7、14天根據分組進行不同治療，實驗前及第28天分別使用經皮水分丟失測試儀Vapometer（Delfin Technologies Ltd，芬蘭）測量小鼠皮膚的TEWL，Corneometer（CM825，Courage and Khazaka，德國）測量角質層含水量，Cutometer MPA 580（Courage & Khazaka electronic GmbH，德國）測量小鼠皮膚彈性。第28天取小鼠背部左右兩側皮膚，將一只小鼠一側背部采集的皮膚標本分為3份，分別用于組織病理、Western blot及RT-PCR檢測。

1.2.1 組織病理：標本用10%福爾馬林固定，包埋石蠟后切片，行HE染色、馬松（Masson）染色、EVG染色、阿申藍-糖原（AB-PAS）染色及MOVAT五色染色，來觀察小鼠皮膚在組織水平上的變化。以上染色所需試劑購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2.2 Western blot法：標本加裂解液進行勻漿，離心后取上清液用于Western Blot。一抗為Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）和α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體，二抗分別為HRP山羊抗兔抗體和HRP山羊抗小鼠抗體，用化學發光法使膠片顯影。以上抗體均購自武漢賽維爾生物科技有限公司。使用Image J軟件對Western blot結果進行相對定量分析。

1.2.3 RT-PCR檢測：標本經液氮研磨后用Total RNA Kit I（R6834-01，Omega）提取總RNA，TransScript cDNA Synthesis Super Mix（AT311-03，北京全式金生物技術有限公司）進行cDNA合成，SYBR Green Master Mix（A25742，Thermo Fisher Scientific）進行RT-PCR，用相對定量分析法2-△△CT計算Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ），α平滑肌肌動蛋白（α-SMA）的相對表達水平。引物序列如表2所示。

表2 RT-PCR所用引物序列

1.3 統計學分析：本研究所得數據用SPSS 26.0統計分析軟件進行分析，用Graphpad Prism 6進行作圖。數據經正態性檢驗，采用獨立樣本t檢驗進行統計學分析，若方差不齊則采用校正t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組皮膚生理指標改變：與基線相比，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組及CNCLHA滾針涂抹組在第28天角質層含水量及皮膚彈性升高，TEWL降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；CNCLHA真皮注射組在第28天與基線相比，皮膚彈性升高，TEWL降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。其他處理組在第28天與基線相比差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組皮膚生理指標變化 （±s）

表3 各組皮膚生理指標變化 （±s）

注：各組皮膚生理指標在第28天與實驗前（基線）相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

組別 角質層含水量/% 皮膚彈性 TEWL/(g/h·m2)實驗前 第28天 實驗前 第28天 實驗前 第28天CNCLHA真皮注射組 74.27±7.22 74.09±9.43 0.2394±0.0686 0.6025±0.0923*** 11.94±2.23 6.95±2.95**CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組 73.62±7.29 85.31±3.42* 0.2767±0.1170 0.5715±0.1149** 10.79±1.27 7.03±1.75*CNCLHA滾針涂抹組 77.84±4.16 81.75±5.61* 0.4921±0.1460 0.8036±0.0684** 8.88±2.40 5.98±1.78*0.9%生理鹽水滾針涂抹組 76.20±8.16 71.28±2.23 0.4762±0.0736 0.6822±0.1246 11.05±1.91 9.10±3.08 0.9%生理鹽水注射組 77.02±5.55 77.34±5.90 0.6041±0.0873 0.4584±0.1258 10.23±3.45 7.12±1.48空白對照組 81.02±6.73 74.78±3.98 0.6048±0.1125 0.5164±0.0828 12.24±2.03 7.82±1.28*

2.2 各組組織病理學改變：HE染色（見圖1）示第28天接受滾針治療的處理組（CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組，0.9%生理鹽水滾針涂抹組）可以看到輕度表皮增厚的反應，而接受真皮注射的處理組（CNCLHA真皮注射組，0.9%生理鹽水注射組）表皮增厚不明顯。接受CNCLHA治療的處理組（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組）可見真皮不同程度增厚，真皮內膠原更加紅染、致密，其中CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組真皮增厚和膠原合成增加最顯著。

圖1 各組小鼠皮膚組織HE染色（100×）

Masson染色可見相比于空白對照組，接受CNCLHA治療的處理組（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組，CNCLHA滾針涂抹組）真皮中藍染的膠原纖維增粗，排列緊密，膠原纖維量CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組＞CNCLHA滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組Masson染色結果見圖2。

圖2 CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組Masson染色結果（100×）

EVG染色可見相比空白對照組，CNCLHA真皮注射組及CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組真皮內不僅膠原纖維數量增加排列緊密，并且有多數黑染的彈力纖維分布在真皮的淺中層；CNCLHA滾針涂抹組可以看到少量彈力纖維新生，主要分布在真皮的淺層。CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組EVG染色結果見圖3。

圖3 CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組EVG染色結果（100×）

AB-PAS染色中酸性粘多糖物質呈藍色，中性粘多糖物質呈紫紅色，混合粘多糖物質呈紫藍色或藍紫色。透明質酸為酸性粘多糖，藍染物質增加說明有新合成的透明質酸。第28天可見CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組藍染物質明顯多于其他生理鹽水處理組及空白對照組，尤其是CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組AB-PAS染色結果見圖4。

圖4 CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組AB-PAS染色結果（100×）

MOVAT染色會使細胞核和彈力纖維呈黑色，蛋白聚糖呈綠色，膠原纖維網狀纖維呈黃色。因此可以同時觀察真皮細胞外基質的三種重要組分（膠原纖維、彈力纖維和透明質酸）。MOVAT染色的結果與上述結果相符，CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組在刺激膠原纖維、彈力纖維和透明質酸新生方面效果更好，尤其是CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組。CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組MOVAT染色結果見圖5。

圖5 CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組與空白對照組MOVAT染色結果（100×）

2.3 Western blot分析：使用Western blot分析第28天各組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ、α-SMA的蛋白表達量。結果顯示，第28天所有處理組與空白對照組相比，Collagen Ⅰ均有不同程度的增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組Collagen Ⅰ含量在所有組中最高，CNCLHA真皮注射組高于0.9%生理鹽水注射組，差異有統計學意義（P＜0.05）。除0.9%生理鹽水注射組外，其余處理組α-SMA含量較空白對照組增多，差異有統計學意義（P＜0.05）；其中CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組＞0.9%生理鹽水注射組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖6～7。

圖6 Western blot分析第28天各組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表達

2.4 RT-PCR檢測結果：使用RT-PCR檢測不同處理組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ和α-SMA的基因表達水平。結果顯示在第28天，所有處理組小鼠皮膚中Collagen Ⅰ相對表達水平較空白對照組升高，但差異無統計學意義（P＞0.05）。而CNCLHA真皮注射組、CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組、CNCLHA滾針涂抹組小鼠皮膚中α-SMA表達量是空白對照組的3倍以上，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖8。

圖7 第28天各組小鼠皮膚Collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表達的相對定量結果

圖8 第28天各組小鼠皮膚Collagen Ⅰ、α-SMA基因表達相對倍數

3 討論

皮膚老化組織學上主要表現為表皮萎縮變薄以及真皮中膠原纖維、彈力纖維、透明質酸等細胞外基質減少[6]，向皮膚中補充外源性透明質酸可以增強皮膚水合能力，提升皮膚體積，改善皮膚老化的表現。由于透明質酸分子量大，直接涂抹很難通過角質層進入皮膚內部，因此臨床上會采用滾針后涂抹或真皮注射的方式將透明質酸直接補充到皮膚深層。已有文獻報道顯示這些方法可以減輕皺紋，改善皮膚顏色、彈性、光澤度、粗糙度、經皮水分丟失、角質層含水量等[3-5]。

本實驗發現單純滾針處理（0.9%生理鹽水滾針涂抹組）可以促進表皮增厚，而滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA滾針涂抹組）可以更好地提高角質層含水量和降低TEWL，促進皮膚屏障的修復。真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射組）則沒有刺激表皮增厚的作用，而聯合給藥（CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組）表皮增厚和皮膚屏障修復的效果更明顯。這可能是由于滾針刺破角質層，產生微損傷可以啟動傷口愈合的進程，從而促進表皮再生[7]；同時滾針產生的微通道能夠增加經皮藥物輸送（Transdermal drug delivery，TDD），使涂抹的透明質酸繞過角質層的屏障功能[8]，直接進入皮膚，提升其鎖水能力，幫助修復皮膚屏障。Aust等[9]對小鼠皮膚滾針后涂抹復合維生素霜，發現與基線相比，8周后單純滾針處理組表皮厚度增加112%，滾針后涂抹復合維生素霜組表皮厚度增加140%，HE染色觀察到滾針后涂抹復合維生素霜組顆粒層增厚，表皮細胞數量增加，角質層更致密。上述結果都支持滾針治療本身有刺激表皮再生的作用，而聯合外涂產品包括本研究中的復方非交聯透明質酸可以更好地促進表皮增厚，修復皮膚屏障。

本次發現滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA滾針涂抹組）小鼠皮膚彈性有所增加，組織病理示CNCLHA滾針涂抹組真皮淺層有少量新生膠原纖維和彈力纖維，Western blot示與空白對照組相比，CNCLHA滾針涂抹組Ⅰ型膠原蛋白水平上升（P＜0.05）。這說明滾針后涂抹非交聯透明質酸不僅對于表皮有促進增生的作用，還可以通過部分上調Ⅰ型膠原蛋白來增加皮膚彈性。相關研究也顯示[7]，對小鼠皮膚進行滾針后涂抹非交聯透明質酸凝膠處理可以增加真皮成纖維細胞數量，促進膠原蛋白產生，刺激真皮血管增生，從而促進組織再生。

本研究還發現接受真皮注射CNCLHA（CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組）小鼠皮膚彈性明顯增加，組織病理結果顯示不同程度的真皮層增厚，膠原纖維和彈力纖維新生，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組最明顯；Western blot結果示CNCLHA真皮注射組，CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組Ⅰ型膠原蛋白水平上升，且CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組＞CNCLHA真皮注射組；CNCLHA真皮注射組＞0.9%生理鹽水注射組＞空白對照組，說明單純真皮注射在增加Ⅰ型膠原蛋白水平有一定的作用，但是該作用不足夠產生肉眼可見的結果以及臨床改善，而真皮注射本身加上復方非交聯透明質酸產品的作用才可以形成臨床效果。Ⅰ型膠原蛋白是真皮中重要的結構蛋白，由成纖維細胞生成，對于保持皮膚彈性有重要作用[10]。本研究發現真皮注射或滾針后外涂復方非交聯透明質酸或聯合給藥均可以刺激Ⅰ型膠原蛋白新生，從而提高皮膚彈性。Scarano等[11]通過人體試驗得到了與本研究結果一致的結論，他們給受試者真皮注射復方非交聯透明質酸，治療后3個月病理示表皮和真皮增厚，成纖維細胞增生，血管數量增加，Masson染色和Van Gieson染色示膠原纖維增生，說明真皮注射非交聯透明質酸能刺激成纖維細胞增殖，顯著促進膠原蛋白、彈力纖維以及真皮基質的合成和血管新生，使真皮增厚、皮膚彈性增加。

研究中還發現，與空白對照組相比，滾針或注射CNCLHA都能增加皮膚中α-SMA水平，Western blot和RTPCR分別證實了α-SMA在蛋白和基因水平的表達增加。α-SMA是成纖維細胞分化為成熟肌成纖維細胞的標志[12]。當成纖維細胞受機械刺激、炎癥或創傷時，產生的多種細胞因子尤其是TGF-β會驅動成纖維細胞分化為表達α-SMA的肌成纖維細胞，后者比前者具有更強的合成膠原等細胞外基質的能力[13]，某種意義上來說肌成纖維細胞也被認為是成纖維細胞的一種活化狀態。本研究證明滾針或注射復方非交聯透明質酸可以通過促進成纖維細胞活化成為表達α-SMA的肌成纖維細胞，從而促進膠原纖維等細胞外基質的合成。

本試驗中發現真皮注射聯合滾針后涂抹CNCLHA（CNCLHA真皮注射聯合滾針涂抹組）在促進表皮增厚、改善皮膚屏障功能，以及促進真皮再生、提高皮膚彈性等方面在所有組中效果最明顯。組織學結果顯示表皮真皮均增厚伴全層大量新生膠原纖維和彈力纖維；Western blot和RT-PCR結果證實了聯合給藥作用最為明顯。也有研究顯示相較于單純真皮注射非交聯透明質酸，真皮注射聯合滾針后涂抹的治療方式對皮膚皺紋、顏色、毛孔、紋理等方面的改善更明顯，恢復期短，患者滿意度高[14]。這為臨床設計治療方案提出了非常好的指導建議，對于同時有表皮、真皮改善需求的就醫者或是老化表現較為明顯，希望短期有較明顯改善者，建議采用真皮注射聯合滾針后涂抹復方非交聯透明質酸的方式，可以達到更好的臨床效果。

綜上所述，通過小鼠實驗證實了不同的給藥模式可以通過刺激表皮或真皮再生起到不同的臨床效果。滾針涂抹的給藥方式通過幫助大分子透明質酸經皮吸收，可以刺激表皮增生，因此在改善皮膚屏障功能和緩解皮膚干燥方面有效，但對于真皮的作用較弱。真皮注射的給藥方式在促進真皮膠原纖維、彈力纖維和細胞外基質增生及重塑方面有一定效果，可以使皮膚增厚，提高皮膚彈性。而聯合真皮注射和滾針后涂抹復方非交聯透明質酸具備了表皮和真皮的雙重療效，各方面改善最為明顯。