HPLC法同時測定貞術(shù)調(diào)脂濃縮丸中5種成分

潘 力， 李 勇， 陳吉生

(1.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510030；2.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006)

貞術(shù)調(diào)脂方由女貞子、白術(shù)、黃連、丹參、三七等藥材組成，具有補益脾腎、疏肝化痰、祛脂降淤之功效，用于治療肝腎不足、濁淤內(nèi)滯所致的高血脂癥，具有確切的降血脂、降血糖作用[1-4]，還可抗骨質(zhì)疏松[5-6]。方中君藥女貞子所含齊墩果酸、特女貞苷有降血脂、降血糖、抑菌抗病毒等作用[7-8]；黃連所含生物堿可保護心血管，有效控制血糖水平[9-10]；丹參水提物所含酚酸能改善脂質(zhì)代謝過程，具有保肝抗炎、降血脂、防治動脈粥樣硬化作用[11-12]。該方在廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院以膠囊劑的形式使用多年，現(xiàn)將其進一步開發(fā)成藥效好、體積小、便于服用的濃縮丸[13-14]，可增加患者依從性，提高療效，節(jié)約成本，但改變劑型后有效成分種類與含量也會隨之變化，前期膠囊劑中相關(guān)測定方法[15-16]已不適用。

因此，本實驗采用HPLC法同時測定貞術(shù)調(diào)脂濃縮丸中特女貞苷、丹酚酸A、丹酚酸B、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量，以期保證該制劑的安全性與有效性，并為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(配置Sampler WPS-3000SL自動進樣器、Chromeleon色譜工作站，美國戴安公司)；RCCHIRAL Gensial C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，4 μm，廣州研創(chuàng)生物技術(shù)發(fā)展有限公司)；SK7200LHC型超聲波清洗器(功率350 W，頻率53 kHz，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；BS224S型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]。

1.2 試劑與藥物 貞術(shù)調(diào)脂濃縮丸(中試加工產(chǎn)品，批號200901、200902、200903)。特女貞苷(批號P25J9L64240，純度98%)、丹酚酸A(批號P28F10F81663，純度98%)、丹酚酸B(批號P18J9F65871，純度98%)對照品均購自上海源葉生物科技有限公司；鹽酸小檗堿(批號110713-201212，純度86.7%)對照品購自中國食品藥品檢定研究院；鹽酸巴馬汀(批號20022610，純度98%)對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 RCCHIRAL Gensial C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm，4 μm)；流動相乙腈(A)-水(B)(含0.1%磷酸、0.2%三乙胺，pH=4.65)，梯度洗脫(0～15 min, 10%A; 15～40 min, 10%～16.5%A; 40～90 min, 16.5%～26.8%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長224 nm。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹酚酸B、特女貞苷、丹酚酸A、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿對照品適量，甲醇溶解，制成分別含丹酚酸B 0.505 0 mg/mL、特女貞苷0.779 6 mg/mL、丹酚酸A 0.685 9 mg/mL、鹽酸巴馬汀0.484 0 mg/mL、鹽酸小檗堿0.533 0 mg/mL的貯備液，分別精密吸取1.58、1.28、0.58、0.41、1.31 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得(含丹酚酸B 0.079 79 mg/mL、特女貞苷0.099 79 mg/mL、丹酚酸A 0.039 78 mg/mL、鹽酸巴馬汀0.019 84 mg/mL、鹽酸小檗堿0.069 82 mg/mL)。

2.3 供試品溶液制備 取本品適量，粉碎，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲(功率350 W、頻率53 kHz)處理20 min，放冷，70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上層清液，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液制備 按照處方中各藥材比例與制備工藝，制得缺丹參、女貞子、黃連的陰性樣品，按“2.3”項下方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性考察與專屬性試驗 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，對照品、供試品溶液色譜圖中均有保留時間相同的色譜峰，而且分離度理想，陰性無干擾，并在陰性樣品溶液未發(fā)現(xiàn)，表明該方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項下對照品溶液，置于同一量瓶中，甲醇稀釋成5種質(zhì)量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.7 精密度試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液1份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得丹酚酸B、特女貞苷、丹酚酸A、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為1.91%、0.48%、2.28%、1.16%、0.94%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法制備供試品溶液1份，室溫下于0、3、6、9、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得丹酚酸B、特女貞苷、丹酚酸A、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積RSD分別為0.92%、0.41%、0.46%、1.88%、0.59%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一批本品(批號200901)，按“2.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得丹酚酸B、特女貞苷、丹酚酸A、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量RSD分別為2.04%、0.17%、1.86%、1.40%、1.08%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批本品(批號200901)適量，粉碎，精密稱取0.25 g，置于具塞錐形瓶中，分別加入“2.2”項下對照品溶液1.10、0.70、0.33、0.29、0.85 mL，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表2。

2.11 樣品含量測定 取3批本品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，外標(biāo)一點法計算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本實驗考察了不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇)、提取時間(10、20、30 min)，發(fā)現(xiàn)70%甲醇超聲提取20 min時各成分能被同時提取，提取率較理想，而且提取液中雜質(zhì)含量較低。

表2 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表3 各成分含量測定結(jié)果(mg/g，n=3)

課題組前期以乙腈-水(含0.1%磷酸)為流動相洗脫時，鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰形較差，峰展開較寬，出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，而加入三乙胺可以改善其峰型[17]，當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.1%時，對色譜基線影響不大，但對上述2種生物堿峰形的改善作用較小；為0.3%時，色譜基線漂移嚴(yán)重，噪音較大，不利于色譜峰的分辨與積分，最終確定為0.2%，此時兩者峰形較好，基線基本平穩(wěn)。另外，由于三乙胺呈堿性，加到流動相中時會對pH產(chǎn)生影響，從而使保留時間不一致，故需再加入微量磷酸或三乙胺調(diào)節(jié)pH至4.65。

4 結(jié)論

本實驗采用HPLC法同時測定貞術(shù)調(diào)脂濃縮丸中丹酚酸B、特女貞苷、丹酚酸A、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量，該方法操作簡便，準(zhǔn)確性、重復(fù)性較好，可為該制劑質(zhì)量控制提供參考。