炎寧糖漿與5種臨床常用藥物對急性肺損傷大鼠的改善作用

魏丹妮， 彭 穎， 馬 萍， 李曉波

(上海交通大學藥學院，上海 200240)

急性肺損傷是臨床常見的由細菌或病毒等感染后所導致的急性炎癥性疾病[1]，其病程快、發病急且致死率高，失控的炎癥反應是急性肺損傷最重要的發病機制之一[2]。臨床敗血癥并發急性肺損傷患者常經歷早期“炎癥風暴”狀態后逐漸向免疫抑制狀態過渡，出現促炎因子和抗炎因子分泌嚴重受阻及免疫功能障礙，機體最終因無力清除致病菌而死亡[3-5]。急性肺損傷缺乏特效治療藥物，目前大多采用保護性機械通氣、ECMO和微循環等支持治療，抗生素和中成藥進行輔助治療[6-7]，其中抗生素常用于治療合并肺部和其他器官感染[8-9]，但其作用效能存在較大差異，需依病情選擇性治療[10]；一些清熱解毒類中成藥具有抗炎、抗氧化、調節機體免疫功能等藥理作用[11]，也在多種急性炎癥性疾病治療中具有一定優勢[12-13]。

炎寧糖漿由鹿茸草、白花蛇舌草、鴨拓草3味中藥組成，具有清熱解毒、消炎止痢之功效[14]，臨床上廣泛用于治療上呼吸道感染、尿路感染、腸炎等多種疾病。前期小鼠耳腫脹和大鼠足腫脹實驗證實，炎寧糖漿總提取物對急性或炎癥早期毛細血管擴張、通透性亢進、滲出、水腫等具有明顯的抑制作用[15-16]，但尚無治療急性肺損傷的報道。本文采用腹腔注射脂多糖誘導急性肺損傷大鼠模型，比較炎寧糖漿、臨床常用抗生素(阿莫西林、阿奇霉素和左氧氟沙星)以及常用中成藥(蒲地藍消炎口服液、連花清瘟膠囊)對大鼠的改善作用，以期為急性肺損傷的用藥提供科學依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雄性，體質量230～290 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK(浙)2019-0001，飼養于上海交通大學動物實驗中心，自由攝食飲水，12 h照明，溫度(25±2) ℃，相對濕度(55±10)%。所有操作均由上海交通大學動物實驗中心倫理委員會審查通過后開展(審查編號A2018100)。

1.2 試劑與藥物 炎寧糖漿(批號1704003)，購自哈爾濱市康隆藥業有限責任公司；阿莫西林(批號1809015)，購自哈藥集團制藥總廠；阿奇霉素(批號200501)，購自天津市健生制藥有限公司；左氧氟沙星(批號BX007A1)，購自第一三共制藥(北京)有限公司；蒲地藍消炎口服液(批號1809613)，購自濟川藥業集團有限公司；連花清瘟膠囊(批號A1801193)，購自石家莊以嶺藥業股份有限公司。LPS(批號028M4094V)，購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay試劑盒(批號12005641)，購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；Rat IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α High Sensitivity ELISA Kit(貨號70-EK380HS-96、70-EK302HS-96、70-EK304HS-96、70-EK306HS-96、70-EK310HS-96、70-EK317HS-96、70-EK382HS-96)，購自杭州聯科生物科技股份有限公司；BCA試劑盒(貨號PC0020)，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器 SYSMEX pocH-100iV Diff 全自動動物血液分析儀，購自希森美康醫用電子(上海)有限公司；Thermo Multiskan MK3酶標儀，購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；電熱鼓風干燥箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；BX53M工業正置顯微鏡，購自奧林斯巴(中國)有限公司；電子天平，購自賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；Bio-Plex MAGPIX System，購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

2 方法

2.1 模型建立 大鼠適應性喂養3 d后隨機分為10組，即空白組，模型組，炎寧糖漿低、中、高劑量組，阿莫西林組，阿奇霉素組，左氧氟沙星組，蒲地藍消炎口服液組，連花清瘟膠囊組，空白組大鼠腹腔注射生理鹽水，模型組、給藥組大鼠腹腔注射LPS(8 mg/kg)，3 h后給藥組大鼠灌胃給予不同藥物，連續3 d，模型組和空白組大鼠灌胃等量蒸餾水，具體見表1。

表1 大鼠分組及給藥方案

2.2 樣本采集 實驗期間，觀察并記錄大鼠造模前后及給藥后體質量、毛色、活躍度、飲食飲水量、大便性狀、死亡情況等指標，計算死亡率。實驗結束后，大鼠腹主動脈取血，取全血1 mL，采用全自動血液分析儀檢測血常規指標(血小板、白細胞、淋巴細胞、中間細胞、粒細胞密度)。另取大鼠全血7 mL至促凝管中，在4 ℃下靜置過夜，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血清分裝，在-80 ℃下保存，結扎右肺下葉和支氣管進行灌洗，摘取肺和腸組織，在-80 ℃下保存，用于后續研究。

2.3 大鼠肺組織濕干重比檢測 取大鼠右肺下葉，濾紙吸干肺表面滲液和血跡，電子天平稱定質量，即濕重，再將其置于65 ℃烘箱中72 h至恒重，即干重，計算濕干重比。

2.4 大鼠肺組織病理變化觀察 大鼠肺組織置于4%多聚甲醛中固定，經常規脫水、石蠟包埋、切片、HE染色后，在顯微鏡下觀察病理變化。參照美國胸科學會[17]及文獻[18-19]報道，對各組大鼠肺損傷程度進行評價，具體見表2。

表2 大鼠肺損傷評分標準

2.5 大鼠肺組織細胞因子檢測 大鼠右肺中葉勻漿后，4 ℃、12 000×g離心20 min，取上清液分裝，在-80 ℃下保存，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

2.6 大鼠血清細胞因子檢測 大鼠全血離心取血清，按照Bio-Plex Pro Rat Cytokine 23-Plex Assay試劑盒說明書，通過Luminex液相芯片技術檢測IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α水平。

3 結果

3.1 炎寧糖漿與5種常用藥物對大鼠體征及死亡率的影響 如圖1A所示，LPS誘導后大鼠初期體質量均下降，出現不同程度精神萎靡，弓背、易驚、蜷臥，進食減少，部分出現大便溏瀉。給藥期間，模型組大鼠仍精神萎靡，眼角和鼻部流出較多血性分泌物，大便干結難解甚至便血，說明LPS誘導后大鼠體征狀況不佳并伴有充血性反應。炎寧糖漿中、高劑量組和阿奇霉素組大鼠較模型組活動增多，反應靈敏，行為學狀態明顯恢復；炎寧糖漿低劑量組、左氧氟沙星組和中成藥(蒲地蘭口服液、連花清瘟膠囊)組大鼠行為學狀態有所好轉但不及炎寧糖漿中、高劑量組和阿奇霉素組；阿莫西林組大鼠行為學狀態較模型組無明顯變化。給藥結束后，模型組大鼠體質量低于空白組(P<0.05)；與模型組比較，炎寧糖漿和阿奇霉素均能升高大鼠體質量(P<0.05，P<0.01)，左氧氟沙星組和中成藥組大鼠體質量有所回升，阿莫西林組大鼠體質量降低，但差異均無統計學意義(P>0.05)。

經LPS造模后，模型組大鼠死亡率達42.9%；連花清瘟膠囊組和炎寧糖漿中、低劑量組大鼠死亡率較低，分別為16.7%、25.0%、33.3%，見圖1B。由此提示，炎寧糖漿和阿奇霉素對大鼠體質量和行為學恢復具有較好的改善作用，連花清瘟膠囊和炎寧糖漿中、低劑量均可一定程度緩解LPS對大鼠造成的毒性，分別降低了61.07%、41.72%、22.38%。

3.2 炎寧糖漿與5種常用藥物對大鼠血常規指標的影響 如表3所示，與空白組比較，模型組大鼠全血中白細胞、淋巴細胞、中間細胞和粒細胞密度均升高(P<0.05)，血小板密度降低了約82.57%(P<0.01)，表明大鼠機體出現嚴重炎癥反應，而且免疫功能出現紊亂。與模型組比較，炎寧糖漿組和阿奇霉素組大鼠血小板密度均呈升高趨勢，其中炎寧糖漿高劑量組差異有統計學意義(P<0.05)，阿奇霉素組大鼠全血中間細胞、粒細胞密度分別降低了60.00%、87.41%(P<0.05)，連花清瘟膠囊組大鼠全血中間細胞密度降低了52.00%(P<0.05)。炎寧糖漿與5種常用藥物對白細胞、淋巴細胞無明顯調節作用(P>0.05)，阿莫西林、左氧氟沙星和蒲地藍消炎口服液對大鼠5項血常規指標無明顯調節作用(P>0.05)。以上結果表明，炎寧糖漿高劑量、阿奇霉素、連花清瘟膠囊對大鼠部分異常血常規指標具有一定改善作用。

3.3 炎寧糖漿與5種常用藥物對大鼠肺水腫的改善作用 如表4所示，與空白組比較，模型組大鼠肺組織濕干重比升高了5.38%(P<0.05)，說明大鼠肺水腫嚴重；與模型組比較，炎寧糖漿中劑量組大鼠肺組織濕干重比降低了4.32%(P<0.05)，其余各給藥組大鼠肺組織濕干重比有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。其中，阿莫西林組大鼠肺濕重低于模型組(P<0.05)，可能與阿莫西林組大鼠體質量減輕有關。以上結果表明，炎寧糖漿中劑量在改善大鼠肺水腫方面可能優于其他抗生素及中成藥。

表3 各組大鼠血常規指標

表4 各組大鼠肺組織濕干重比

3.4 炎寧糖漿與5種常用藥物對大鼠肺組織病理變化的影響 如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠肺組織結構被破壞，肺泡腔和肺組織間質內伴有大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔偶見透明膜形成，亦可見蛋白質殘留物，且模型組大鼠肺損傷評分升高(P<0.01)，表明大鼠肺部病理損傷嚴重。與模型組比較，炎寧糖漿中、高劑量組、阿奇霉素組和蒲地蘭消炎口服液組大鼠肺泡壁變薄，肺泡壁和肺泡腔內炎癥細胞數量及肺泡腔內透明膜和蛋白質碎片減少，肺損傷評分降低(P<0.05，P<0.01)；炎寧糖漿低劑量組、阿莫西林組、左氧氟沙星組和連花清瘟膠囊組大鼠恢復程度不如其他給藥組，肺泡腔和肺組織間質內有較多炎癥細胞浸潤，肺損傷評分無明顯變化(P>0.05)。以上結果表明，中、高劑量炎寧糖漿、阿奇霉素及蒲地蘭消炎口服液對大鼠肺組織形態異常的改善作用可能較其他給藥組更為明顯。

3.5 炎寧糖漿與5種常用藥物對大鼠血清、肺組織細胞因子的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Th1型(IFN-γ)、Th2型(IL-2、IL-4)、Th17型(IL-17A)、Treg型(IL-10)、IL-6水平均降低(P<0.01)，而模型組大鼠肺組織上述7種細胞因子水平均無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，炎寧糖漿能上調血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，阿奇霉素能上調血清IL-4、IL-10水平(P<0.05)，左氧氟沙星能上調血清IL-17A水平(P<0.05)，蒲地藍消炎口服液能上調血清IL-2、IL-4、IL-17A水平(P<0.05，P<0.01)，見圖3。與模型組比較，炎寧糖漿能下調肺組織IL-6水平(P<0.05)，阿奇霉素能上調肺組織IL-17A水平(P<0.05)，蒲地蘭消炎口服液能下調肺組織IL-2、IL-6水平(P<0.05，P<0.01)，連花清瘟膠囊能下調肺組織IL-6、IL-10水平(P<0.01)，而阿莫西林對大鼠血清和肺組織上述7種細胞因水平子均無顯著調節作用(P>0.05)，見圖4。上述結果提示，炎寧糖漿、蒲地蘭口服液均能較好地改善大鼠血清中免疫抑制狀況，促進血液中受阻的Th1型、Th2型和Th17型細胞因子分泌，從而一定程度上恢復機體免疫平衡。

4 討論

研究發現，免疫抑制及嚴重免疫功能障礙常發生于臨床敗血癥并發急性肺損傷患者后期，患者脾臟細胞出現促炎因子和抗炎因子分泌大量減少，嚴重威脅患者生存[3-5]。本研究結果顯示，LPS誘導后模型組大鼠血清中多種促炎因子和抗炎因子分泌嚴重受阻，表明機體發生免疫功能障礙且處于全身性免疫抑制及繼發性低炎狀態中。與血清細胞因子不同，模型組大鼠肺組織多種細胞因子與空白組比無明顯差異，推測可能作為急性肺損傷最早受累且損傷最嚴重的器官[20]，肺臟仍處于“高炎”向“低炎”過渡階段，較急性肺損傷機體血液系統恢復更緩慢。

中藥對大鼠改善作用研究多采用預防給藥模式[21-23]，與臨床差異較大。本研究采用腹腔注射LPS大鼠模型，模擬臨床多發的由肺外因素導致急性肺損傷的發病特征，同時結合“先病后治”特點，在造模后給予不同藥物。結果發現，中、高劑量炎寧糖漿可減輕肺組織病理損傷，在減輕急性肺損傷大鼠肺水腫和改善血小板減少方面作用較突出，但在改善白細胞水平方面不及阿奇霉素和連花清瘟膠囊。炎寧糖漿能有效逆轉多種炎癥因子如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-17A等異常分泌，以高劑量作用最顯著。研究發現IFN-γ、IL-2主要由Th1細胞分泌，可誘導巨噬細胞活化，發揮對抗胞外病原菌作用，介導細胞免疫應答[24-25]。IL-4主要由Th2細胞分泌，能促進抗體生成并介導體液免疫。IL-17A是Th17細胞特異性分泌的細胞因子，不僅可誘導中性粒細胞在炎癥部位聚集，還能延遲活化的中性粒細胞在炎癥部位凋亡，但也可能導致組織損傷[26-27]。因此推測炎寧糖漿可能通過促進急性肺損傷大鼠免疫抑制狀態下Th型和Treg型細胞因子分泌以促進機體免疫功能恢復。本研究發現，阿奇霉素(大環內酯類抗生素)對大鼠的改善作用較其他2種抗生素更突出，主要體現在改善急性肺損傷大鼠肺組織結構，逆轉大鼠血液中白細胞及炎癥因子水平的異常變化等。連花清瘟膠囊、蒲地蘭消炎口服液和左氧氟沙星(喹諾酮類抗生素)對大鼠部分異常指標具有一定調控作用。此外，連花清瘟膠囊在降低動物致死率方面作用突出，但在其他藥效指標上不及炎寧糖漿和阿奇霉素，其作用機理有待進一步研究。阿莫西林(β-內酰胺類抗生素)對LPS誘導后大鼠各項指標無明顯調控作用。不同藥物調控急性肺損傷大鼠血清與肺組織細胞因子的種類和程度存在差異，可能與藥物特性有關。而3種中成藥雖對血清中IL-6無顯著調控作用，但均能降低肺組織IL-6水平，可能通過中藥的多成分、多靶點、多途徑調控肺臟，從而加快靶器官渡過“高炎期→低炎期”的機體修復進程。

綜上所述，抗生素阿奇霉素較阿莫西林和左氧氟沙星更有效減輕LPS誘導后大鼠癥狀；中成藥(炎寧糖漿、蒲地蘭消炎口服液和連花清瘟膠囊)對大鼠均具有一定改善作用但特點不同，其中，炎寧糖漿在改善急性肺損傷大鼠肺水腫、血小板減少、多種炎癥因子分泌失調等方面發揮了較好作用。