納豆發酵對黃芩代謝轉化的研究

高騰美， 楊涵月， 常 娟， 常銀霞， 魏硯明， 劉必旺

(山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 太原 030619)

黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，主要有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫等藥理作用[1-2]，其中黃芩苷含量一般不低于9.0%，漢黃芩苷含量為2.0%～8.0%，黃芩素含量為0.10%～1.60%，漢黃芩素含量為0.01%～0.30%[3-4]。黃芩苷、漢黃芩苷分別為黃芩素、漢黃芩素的葡萄糖醛酸化合物，含有糖苷，脂溶性差，轉化為黃芩素等苷元在小腸中才能被直接吸收[5]。黃芩素等苷元具有更強的抗腫瘤、抗炎癥、抗氧化等功能活性，生物利用度更高[6-9]。

將黃芩苷轉變為黃芩素的方法包括酸堿水解法、酶解法和微生物發酵法[10]，其中微生物轉化法具有反應特異性強、條件溫和、副產物少、清潔環保等優點[11]。黃酮、生物堿、萜類、皂苷、多酚等中藥成分均可采用生物轉化[12-15]。姚磊等[16]以牛肉膏為培養基，利用納豆菌微生物發酵黃芩，但培養過程繁瑣，成本高，時間長；本實驗采用納豆發酵黃芩，無須加入牛肉膏等其他培養基，可快速將黃芩苷轉化為黃芩素等苷元，具有發酵速度快、轉化率高、成本低、實用性強的特點。

1 材料

1.1 儀器 MC-101C納豆機(中山市名臣電器有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀，配置Waters 2998 PDA 檢測器(美國Waters公司)；半微量型號New Classic MS電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；PH-070A干燥箱、HWS-26電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學儀器有限公司)；LGJ-10型冷凍干燥機(金西盟北京儀器有限公司)；HL-200高速多功能粉碎機(上海塞耐機械有限公司)。

1.2 試劑與藥物 黃芩(山西元和堂中藥有限公司，產地山西，批號200201)，經山西中醫藥大學中藥與食品工程學院藥用植物教研室樊杰副教授鑒定為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根。納豆菌菌粉(青島凱麥森食品科技有限公司)。黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為P20A9F39333、C04D8Y49741、R31M9F62605、P11M9F61014)。甲醇、乙腈(天津市科密歐化學試劑有限公司)。

2 方法與結果

2.1 納豆制備 選取小粒干黃豆約300 g，加水浸泡8 h后放入高壓鍋內蒸90 min，冷卻至室溫，加入1 g納豆發酵菌粉，攪拌均勻，放入自動納豆發酵機中發酵，溫度約37 ℃，發酵24 h后取出放入保鮮袋內，室溫放置30 d以上(發酵時間過短，酶活性、黃芩苷轉化率低；發酵30 d以上，黃芩苷轉化率趨于穩定)，即得。

2.2 發酵步驟 稱取藥材粉末適量，高壓滅菌后加入2倍量滅菌水、納豆(研磨成泥狀)，在一定溫度下發酵，一段時間后在60 ℃下恒溫干燥24 h以終止發酵。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材或發酵品0.3 g(扣除納豆質量)，加70%乙醇40 mL，水浴加熱回流3 h，放冷，濾過，少量70%乙醇分次洗滌容器和殘渣，濾液置于100 mL量瓶中，70%乙醇定容，精密量取1 mL，甲醇定容至10 mL，即得。

2.4 色譜條件 Thermo BDSHYPERSIL C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相甲醇(A)-乙腈(B)-0.1%甲酸(C)，梯度洗脫(0～8 min，15%～34%A，5%～6%B；8～25 min，34%～55%A，6%～7.5%B；25～35 min，55%～66%A，7.5%～8%B；35～45 min，66%～80%A，8%～10%B)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長278 nm；進樣量20 μL。

2.5 方法學考察

2.5.1 專屬性試驗和線性關系考察 取對照品、藥材、發酵品溶液適量，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖1，可知各成分色譜峰達到基線分離。另精密稱取上述4種對照品適量，加適量甲醇超聲溶解，制成質量濃度分別為0.60、0.40、0.68、0.50 mg/mL的溶液，稀釋成5個質量濃度，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，以對照品質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表1 各成分線性關系

2.5.2 精密度試驗 取同一份對照品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定5次，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.42%、0.54%、0.27%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性試驗 取同一批發酵品，按“2.3”項下方法制備5份供試品溶液，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD為0.58%～1.54%，表明該方法重復性好。

2.5.4 穩定性試驗 取同一批發酵品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、8、12、24 h在“2.4”項色譜條件下進樣測定，測得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素峰面積RSD分別為0.57%、0.59%、0.62%、0.63%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 取同一批發酵品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，稀釋成高、中、低質量濃度，在“2.4”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素平均加樣回收率為98.15%～101.23%，RSD為0.58%～0.91%。

2.6 單因素試驗

2.6.1 粒徑 精密稱取10、20、40、60目黃芩粉末各15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發酵溫度37 ℃，按“2.2”項下方法發酵2 d。結果，黃芩苷轉化率分別為84.15%、92.45%、96.87%、96.32%，即粒徑為40目時最高。

2.6.2 黃芩與納豆比例 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定發酵溫度37 ℃，黃芩與納豆比例分別為4∶1、3∶1、2∶1、1∶1，按“2.2”項下方法發酵2 d。結果，黃芩苷轉化率分別為93.61%、96.86%、95.27%、94.44%，即黃芩與納豆比例為3∶1時最高。

2.6.3 發酵溫度 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發酵溫度分別為33、35、37、39 ℃，按“2.2”項下方法發酵2 d。結果，黃芩苷轉化率分別為68.60%、76.06%、96.87%、85.24%，即發酵溫度為37 ℃時最高。

2.6.4 發酵時間 精密稱取40目黃芩粉末15 g，固定黃芩與納豆比例3∶1，發酵溫度37 ℃；按“2.2”項下方法分別發酵1、2、3、4 d。結果，黃芩苷轉化率分別為91.81%、96.85%、96.87%、96.88%，即發酵時間為4 d時最高，但2 d后變化程度不明顯。

2.7 正交試驗 在單因素試驗基礎上，選擇粒徑(A)、黃芩與納豆比例(B)、發酵時間(C)、發酵溫度(D)作為影響因素，黃芩苷轉化率(Y)作為評價指標，每個因素3個水平，見表2。

稱取黃芩27份，每組3份，每份15 g，按L9(34)正交表進行試驗，結果見表3，方差分析見表4。由表3可知，最優工藝為A2B2C2D2，即粒徑40目，黃芩與納豆比例3∶1，發酵時間2 d，發酵溫度37 ℃，黃芩苷轉化率為96.87%。由表4可知，各因素影響程度依次為發酵溫度>發酵時間>粒徑>黃芩與納豆比例。

表2 因素水平

表3 試驗設計與結果

表4 方差分析

2.8 發酵前后成分含量比較 稱取黃芩15 g，共3份，按“2.7”項下優化工藝進行發酵，結果見表5～6，可知發酵后黃芩苷、漢黃芩苷含量明顯降低，黃芩素、漢黃芩素含量明顯升高。

表5 黃芩苷、黃芩素含量測定結果(n=3)

表6 漢黃芩苷、漢黃芩素含量測定結果

3 討論

在相同發酵條件下，不同發酵時間的納豆對黃芩苷轉化為黃芩素有較大的影響。納豆發酵時間越長，黃芩苷轉化越快，發酵30 d以上后發酵速度趨于穩定。

發酵3 d時，納豆激酶的活性和含量最高。納豆在長期發酵過程中會產生納豆纖溶酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化物歧化酶等[17-18]，說明納豆發酵黃芩轉化機理可能與增加的β-葡萄糖苷酶有關，還與納豆發酵產生的其它多種活性酶有關，納豆發酵時間長產生酶的種類多是黃芩發酵速度變快的主要原因。

4 結論

本實驗采用納豆發酵黃芩，可縮短黃芩發酵時間，最優發酵工藝為粒徑40目，黃芩與納豆比例3∶1，發酵溫度37 ℃，發酵時間2 d，黃芩苷、漢黃芩苷分別轉化成其苷元黃芩素、漢黃芩素，轉化率分別為96.87%、86.38%。姚磊[16]等報道，優化工藝為發酵時間7 d，黃芩苷平均轉化率為96.50%；本實驗發酵時間短，黃芩苷轉化率相當，不需加入牛肉膏等培養基，成本低，并且納豆可提供發酵所需的碳源和氮源。