白頭翁皂苷B4藥理作用研究進(jìn)展

袁 進(jìn)， 張麗峰， 高紅偉， 冷 靜*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530000；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西高發(fā)傳染病中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530000；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530000)

白頭翁是一種傳統(tǒng)中藥，最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用部位是毛茛科植物白頭翁的干燥根，其味苦性寒，歸胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲等功效，臨床主要用于治療阿米巴痢疾、急慢性炎癥、消化性潰瘍等[1-2]。白頭翁皂苷是白頭翁中具有生物活性的五環(huán)類三萜成分[3]，具有抗血吸蟲、抗炎、抗菌、活化血管、抗腫瘤、認(rèn)知增強(qiáng)等多種藥理作用[4-10]，白頭翁皂苷B4(Anemoside B4，AB4)是其中的有效皂苷，含量豐富，價(jià)格低廉，容易轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用藥物，也有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、腎損傷保護(hù)、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等活性，相關(guān)作用機(jī)制見圖1。本文對AB4藥理作用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為該成分開發(fā)利用提供參考。

1 抗腫瘤

AB4在小鼠S180腫瘤異種移植瘤中，未明顯降低順鉑抗腫瘤活性[11]，后者在3 mg/kg劑量下腹腔注射給藥10 d后腫瘤生長抑制率為95.1%，而AB4預(yù)處理后為98.4%，并且該成分對小鼠毒性較低。王海俠等[12]報(bào)道，AB4可調(diào)控肝癌細(xì)胞周期，阻滯G2/M期更替，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。薛淑一等[13]發(fā)現(xiàn)，在體外AB4可能通過下調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)，上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)X蛋白(Bax)，增大Bax/Bcl-2比例，激活半胱天冬酶(caspase)家族，活化含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)，作用于多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)，促使肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，同時(shí)通過構(gòu)建肝癌裸鼠異種移植模型發(fā)現(xiàn)，它可明顯抑制腫瘤生長，抑瘤率為25.93%～46.26%，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)AB4干預(yù)后腫瘤組織細(xì)胞輪廓模糊, 細(xì)胞邊界不清晰, 形狀不規(guī)則, 大小不一, 出現(xiàn)核固縮、核質(zhì)不清晰、核碎裂等現(xiàn)象，并隨其劑量增加更明顯，但具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。Xue等[14]研究表明，AB4有抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬的作用，主要機(jī)制為AB4抑制蛋白激酶(Akt)和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)磷酸化，從而誘導(dǎo)凋亡和自噬。因此，AB4與其他磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt/mTOR抑制劑聯(lián)合使用時(shí)，可能會(huì)更有效地殺死癌細(xì)胞，同時(shí)在Belin-1-LC3-p62級聯(lián)反應(yīng)中能導(dǎo)致Bclin-1積累及自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)、p62降解，在自噬抑制劑CQ的作用下使AB4誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬逆轉(zhuǎn)。

子宮頸癌是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第三大原因[15]，中藥可通過不同途徑對子宮頸癌細(xì)胞有抑制侵襲和轉(zhuǎn)移作用[16-17]。任楠楠等[18]以人宮頸癌細(xì)胞HeLa為對象，給予AB4刺激48 h后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較,該成分能顯著抑制HeLa細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與抑制Notch信號通路Notch1蛋白表達(dá)、促進(jìn)自噬相關(guān)分子Beclin1和Atg5表達(dá)相關(guān)。

結(jié)直腸癌是世界上第三大癌癥[19]，臨床上最常用的化療藥物之一是奧沙利鉑(oraliplatin，L-OHP)，但患者通常會(huì)產(chǎn)生耐受[20]。李敏等[21]發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷B4可逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo/L-OHP的耐藥作用，主要是在無毒劑量下作用于結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞L-OHP中，此時(shí)耐藥細(xì)胞P-糖蛋白(P-gp)基因表達(dá)、P-gp蛋白表達(dá)下降，耐藥性逆轉(zhuǎn)為1.79倍，經(jīng)過有輕微毒性劑量的AB4治療后，G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞略有增加，推測白頭翁皂苷B4降低LoVo/L-OHP細(xì)胞耐藥性的機(jī)制可能是降低P-gp表達(dá)。

2 抗炎

炎癥部位的微血管內(nèi)皮細(xì)胞是炎癥過程的積極參與和調(diào)節(jié)者[22]，其功能在從急性炎癥向慢性炎癥轉(zhuǎn)變、固有免疫向適應(yīng)性免疫轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)生變化，作用于內(nèi)皮細(xì)胞的介質(zhì)也作用于白細(xì)胞，反之亦然，故許多抗炎治療主要通過靶向內(nèi)皮細(xì)胞和血管治療[23]。Cao等[24-25]證明，AB4也可通過誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素2(IL-2)來影響腸道和內(nèi)臟功能。慢性子宮內(nèi)膜炎會(huì)導(dǎo)致女性生理、心理、妊娠健康問題[26]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，AB4凝膠能明顯降低慢性子宮內(nèi)膜炎(CE)模型大鼠子宮組織中白細(xì)胞介素-6(IL-6)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)mRNA、蛋白表達(dá)，并能下調(diào)STAT3的活化形式p-STAT3蛋白表達(dá)；大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，AB4能明顯降低脂多糖(LPS)刺激大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6水平，糖蛋白(gp130)和STAT3 mRNA表達(dá)[27]。肺炎是一種常見的嚴(yán)重急性下呼吸道感染疾病[28]，He等[29]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，AB4具有調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子[如白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)]的潛力，還可通過抑制Toll樣受體/髓樣分化蛋白抗原(TLR4/Myd88)信號通路活化，對肺炎克雷伯菌或流感病毒FM1感染導(dǎo)致的肺炎起到顯著保護(hù)作用。

Yuan等[30]發(fā)現(xiàn)，AB4通過阻斷TLR4二聚化和域蛋白(NLRP3)炎癥小體激活對急性肺損傷(ALI)起到保護(hù)作用，可能是治療ALI的潛在藥物，具體方法是在體外建立LPS、三磷酸腺苷(ATP)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞THP-1炎癥模型，給予3種濃度AB4，可顯著抑制巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-1等炎癥因子釋放，并且挽救LPS、ATP刺激巨噬細(xì)胞的線粒體膜電位(MMP)損失。免疫共沉淀(Co-IP)和分子對接結(jié)果表明，AB4破壞了TLR4的二聚化。LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠均在96 h內(nèi)死亡，但AB4(5、10 mg/kg)治療組在144 h內(nèi)明顯提高了存活率(80%)，與陽性藥地塞米松(DEX)相似，甚至在更低劑量下(2.5 mg/kg)也有顯著保護(hù)作用。AB4對LPS、BLM誘導(dǎo)的ALI小鼠模型也具有保護(hù)作用，主要是減少肺組織損傷、降低炎性細(xì)胞因子釋放及血液中白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平，蘇木精-伊紅染色(HE染色)顯示模型組小鼠肺泡間質(zhì)滲出明顯，肺泡正常結(jié)構(gòu)破壞，大量炎癥細(xì)胞浸潤，而AB4可改善上述病變。從核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)p65分子機(jī)制層面，周朦靜等[31]也發(fā)現(xiàn)AB4可改善LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷，在低劑量組下明顯抑制NF-κB p65蛋白的表達(dá)。

Ma等[32]采用3%DSS建立C57BL/6小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，分別腹腔注射AB4、口服美沙拉嗪，采用疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)對臨床癥狀進(jìn)行評分，HE染色觀察組織病理改變，發(fā)現(xiàn)該成分AB4可防止DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕、結(jié)腸長度縮短，改善結(jié)腸組織病理變化，同時(shí)顯著降低結(jié)腸組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，其機(jī)制可能為AB4抑制DSS誘導(dǎo)的TLR4信號通路激活，并下調(diào)LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB/MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)。也有學(xué)者在正常、潰瘍性結(jié)腸炎大鼠體內(nèi)探討了AB4藥動(dòng)學(xué)，發(fā)現(xiàn)該成分可通過多種有效途徑降低炎癥反應(yīng)，從而緩解腸道功能障礙[33]。

3 抗病毒

豬圓環(huán)病毒2型(PVC2)通過失調(diào)細(xì)胞miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)來調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)[34]，Hu等[35]發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，AB4高劑量組白細(xì)胞介素-10(IL-10)、PCV2攻擊小鼠的宿主死亡率和特定病理的發(fā)生率/嚴(yán)重程度(體溫降低、體質(zhì)量減輕、白細(xì)胞和血小板水平減少、內(nèi)臟腫脹和病變)。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)會(huì)損傷自身免疫系統(tǒng)，而AB4通過發(fā)揮抗炎作用對PVC2和PRRSV有抑制效果。Yang等[36]報(bào)道，AB4可明顯降低PVC2誘導(dǎo)的免疫病理損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，同時(shí)顯著提高總蛋白、白蛋白、免疫球蛋白(IgG、IgM)水平。Hu等[37]將對照仔豬肌肉注射含1×106TCID50病毒/mL的PRRSV(NJGC株)溶液2 mL；不同劑量白頭翁皂苷B4處理組先給豬等量PRRSV溶液，再于第3天腹腔注射1、5、10 mg/kg AB4；藥物對照組仔豬未經(jīng)PRRS激發(fā)，腹腔注射10 mg/kg白頭翁皂苷；空白對照組仔豬注射等量生理鹽水，發(fā)現(xiàn)AB4能降低PRRSV誘導(dǎo)的免疫病理損傷的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，證明AB4對PRRSV感染具有潛在治療作用。

4 腎保護(hù)

Gong等基于腺嘌呤誘發(fā)的大鼠腎臟損傷模型，研究AB4在慢性腎臟損傷(CKI)的作用和相關(guān)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)腎衰模型組大鼠均表現(xiàn)出無精打采、皮毛粗糙凌亂、體質(zhì)量減輕、活動(dòng)減少的現(xiàn)象，而AB4干預(yù)后上述現(xiàn)象得到改善。AB4可顯著降低尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、尿蛋白表達(dá)，抑制IL-6、IL-1β、NFκB、NLRP3、半胱天冬酶1、ASC、IL-18表達(dá)，增加腺嘌呤水平，促進(jìn)其排泄，AB4還能上調(diào)2種主要足細(xì)胞蛋白podocin、nephrin表達(dá)，減少腎間質(zhì)中纖維膠原蛋白表達(dá)，表明該成分除了具有抗炎作用外，還可保護(hù)腎小球基質(zhì)免受腺嘌呤損傷[38]。建立慢性腎功能衰竭(chronicrenalfailure，CRF)大鼠模型后給于AB4干預(yù)，發(fā)現(xiàn)該成分可通過降低血清中Scr、BUN水平，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，減少炎癥因子釋放來起到抗炎作用，從而保護(hù)腎臟損傷，也能通過激活PI3K通路來減少腎臟細(xì)胞凋亡[39-40]。He等[11]報(bào)道，體外實(shí)驗(yàn)中AB4可有效提高順鉑處理后HEK-293T細(xì)胞的濃度和時(shí)間，抑制細(xì)胞凋亡，降低活性氧(ROS)水平，改善超氧化物歧化酶(SOD)活性，有效調(diào)節(jié)體質(zhì)量和腎臟指數(shù)，降低順鉑升高的BUN、CREA的水平，減輕組織病理學(xué)損傷。

李俊等[41]發(fā)現(xiàn)，AB4可減輕大鼠腎臟缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與AB4參與的NLRP3、TLR4/NF-κB途徑介導(dǎo)的抑制炎癥反應(yīng)因素有關(guān)，并可顯著下調(diào)腎臟中p53、Bax蛋白表達(dá)[40]，提示該成分對順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制主要與p53信號通路的調(diào)控有關(guān)，同時(shí)在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AB4對LPS誘導(dǎo)的HEK293細(xì)胞損傷有保護(hù)作用[42]。但何鹿玲等[43]報(bào)道，AB4對腺嘌呤誘導(dǎo)的上調(diào)蛋白的抑制作用不明顯，主要是基于30%AB4對腺嘌呤誘導(dǎo)的蛋白上調(diào)的抑制率，對于腺嘌呤顯著下調(diào)的蛋白，AB4可使其表達(dá)上調(diào)高達(dá)40%；對于其顯著上調(diào)的蛋白，AB4可抑制其表達(dá)30%，其原因?yàn)橐环矫嬖摮煞挚赡孓D(zhuǎn)腺嘌呤引起的蛋白下調(diào)，而另一方面可抑制由腺嘌呤引起的6個(gè)上調(diào)基因，主要涉及細(xì)胞周期、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、PI3K-Akt等信號通路。由此可知，AB4對這種腎功能損害改善作用是全面廣泛的。

5 鎮(zhèn)痛

張沛等[44]利用熱板實(shí)驗(yàn)、醋酸致小鼠扭體模型、甲醛模型發(fā)現(xiàn)，白頭翁皂苷B4有明顯的鎮(zhèn)痛作用。首先，在熱板實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組、對照組結(jié)果無明顯差異，提示該成分鎮(zhèn)痛作用對有高位中樞參與精細(xì)調(diào)控的疼痛反應(yīng)作用不明顯。其次，在自發(fā)活動(dòng)、疲勞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)AB4不會(huì)影響小鼠運(yùn)動(dòng)能力，也沒有出現(xiàn)肌肉松弛現(xiàn)象。最后，檢測AB4對小鼠機(jī)械疼痛域的影響，發(fā)現(xiàn)AB4可提高小鼠機(jī)械疼痛閾值。

在醋酸致小鼠扭體模型[45]中，AB4各劑量組均能減少小鼠扭體次數(shù), 有良好鎮(zhèn)痛作用；在甲醛模型中也發(fā)現(xiàn)，AB4具有明顯的抑制甲醛誘發(fā)炎性疼痛作用，主要表現(xiàn)為減少小鼠第2相舔足時(shí)間和次數(shù)。但AB4具體鎮(zhèn)痛機(jī)制不明確，尚需進(jìn)一步研究。

6 免疫調(diào)節(jié)

T淋巴細(xì)胞來源于骨髓，成熟于胸腺，在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中占核心地位[46]，外周成熟T細(xì)胞主要分為CD4+輔助性T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞[47]。Kang等[48]基于脂多糖誘導(dǎo)的全身性炎癥小鼠模型，通過脾細(xì)胞增殖、遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)、T細(xì)胞亞型測定發(fā)現(xiàn)，AB4可顯著降低LPS誘導(dǎo)全身性炎癥模型的CD4+/CD8+T細(xì)胞比率。同時(shí)，基于二硝基氟苯(DNFB)誘導(dǎo)的DTH模型研究結(jié)果表明，AB4可抑制DTH反應(yīng)，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

Yang等[36]報(bào)道，AB4可通過調(diào)節(jié)免疫球蛋白、血紅蛋白水平來對抗病毒感染引起的免疫調(diào)節(jié)作用和相關(guān)綜合征，主要表現(xiàn)為該成分干預(yù)PCV2感染小鼠模型后總蛋白、IgG水平升高、白細(xì)胞和紅細(xì)胞數(shù)量增加。另外，在PRRSV攻擊內(nèi)皮細(xì)胞后，AB4可能通過上調(diào)IL-2水平來有效地調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[25]，但在固有免疫方面尚待研究。

7 結(jié)語

AB4對肝癌、子宮頸癌、結(jié)直腸癌均有一定抑制作用，其機(jī)制可能與PI3K/Akt/mTOR途徑、細(xì)胞周期G2/M、Notch信號通路、P-gp有關(guān)；也有一定抗炎作用，主要是通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)TLR4信號通路來發(fā)揮；對于腎保護(hù)作用而言，AB4機(jī)制可能與抗氧化、調(diào)控p53信號通路、減少炎癥因子、PI3K通路、DTH有關(guān)。另外，AB4也具有抗病毒、鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

雖然本文對AB4藥理作用進(jìn)行了概述，但其具體機(jī)制還有待研究[49]，在抗腫瘤方面目前只發(fā)現(xiàn)該成分在肝癌、子宮頸癌、結(jié)直腸癌中有抑制作用，還有許多有關(guān)AB4對癌癥治療還有待發(fā)現(xiàn)，總體而言相關(guān)研究主要集中在抗炎作用。雖然AB4具有化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、作用機(jī)制可循的優(yōu)點(diǎn)，但也有許多不足之處，如細(xì)胞實(shí)驗(yàn)居多，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不足，對疾病作用靶點(diǎn)及機(jī)制不明確；研究思路有待創(chuàng)新。因此，可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)AB4潛在治療靶點(diǎn)，利用Crispr cas9技術(shù)敲除或過表達(dá)基因，驗(yàn)證差異基因在AB4作用中的功能；將AB4用熒光標(biāo)記，應(yīng)用蛋白與細(xì)胞膜分子相互作用技術(shù)發(fā)現(xiàn)其結(jié)合靶分子；通過人源化小鼠腫瘤模型驗(yàn)證AB4抗腫瘤效應(yīng)及機(jī)制，更特異性地治療相關(guān)臨床疾病，從而使該成分能更好地應(yīng)用于臨床，為患者提供更安全、有效、實(shí)惠的治療手段。