肉蓯蓉總苷通過調控lncRNA GAS5保護神經細胞缺血再灌注損傷

樊燕燕， 張石在

(鄂爾多斯應用技術學院醫學系，內蒙古 鄂爾多斯 017000)

腦缺血是最常見的臨床疾病之一，血運快速重建是腦缺血最有效治療方法之一，然而再灌注可引起缺血區域氧化應激和炎癥損傷，導致神經元凋亡，進一步加重腦損傷[1]。因此，保護神經元細胞免受缺血再灌注(I/R)損傷將為缺血性腦病治療提供理論參考。肉蓯蓉總苷是肉蓯蓉中主要活性成分，具有滋補肝腎、益精血、抗氧化、抗衰老、免疫增強和神經保護作用[2]。早期研究顯示，肉蓯蓉總苷可減少降低腦組織梗死面積，增強抗氧化酶活性，防止脂質過氧化，減輕腦組織病理損傷，抑制腦細胞凋亡，對小鼠腦I/R具有保護作用[3-4]。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類缺乏編碼能力、長度大于200 nt的RNA轉錄本，近年來研究證實lncRNA是大腦發育和許多神經系統疾病的重要調節劑。lncRNA生長停滯特異性轉錄本5(GAS5)因在雷帕霉素誘導的細胞周期阻滯中表達升高而得名，已有研究顯示在缺氧誘導的神經元中lncRNAGAS5表達上調，并對細胞存活具有負調控作用[5]。抑制lncRNAGAS5表達可增加深低溫停循環(DHCA)后神經元存活數量，改善大鼠DHCA后認知和記憶功能，減輕大鼠DHCA后腦損傷[6]。本研究以PC12細胞氧糖剝奪再復氧復糖模型模擬體外腦缺血再灌注損傷[7]，觀察肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞活力、凋亡、炎癥反應的影響，并探討其機制是否與調控lncRNAGAS5表達有關。

1 材料

1.1 細胞 大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 試劑與藥物 肉蓯蓉總苷(純度80%，貨號YN048)購自山西玉寧生物科技有限公司，實驗時用含血清培養基配置所需濃度。人工腦脊液購自南京億迅生物科技有限公司；膜聯蛋白V(Annexin-V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒購自杭州聯科生物技術股份有限公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)、兔源半胱氨酸蛋白酶3前體(pro-caspase3)、裂解的caspase3(cleaved-caspase3)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、羊抗兔IgG抗體購自上海碧云天生物技術有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒上海廣銳生物科技有限公司；SYBR-Green Master Mix、逆轉錄試劑盒購自寶生物工程 (大連) 有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養和模型構建 PC12細胞采用DMEM培養基(補充10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素雙抗)置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養。糖氧剝奪模型制備參考張蕾等[7]報道方法進行，選取對數生長期細胞進行實驗，將DMEM培養基更換為無糖無血清的人工腦脊液模擬無氧無糖環境，置于37 ℃含95% N2、5% CO2缺氧培養箱培養4 h。

2.2 實驗分組和處理 細胞分為對照組，PC12細胞不進行糖氧剝奪，僅更換為無血清DMEM培養基于正常培養箱培養24 h；I/R組，PC12細胞氧糖剝奪4 h后，更換為無血清DMEM培養基于正常培養箱培養20 h；肉蓯蓉總苷低、中、高劑量組，PC12細胞氧糖剝奪4 h后，更換為含6.5、12.5、25.0 μg/mL肉蓯蓉總苷[4]的無血清DMEM培養基復氧復糖20 h；si-NC組、si-GAS5組，分別轉染si-NC、si-GAS5的PC12細胞氧糖剝奪4 h后，更換為無血清DMEM培養基于正常培養箱培養20 h；肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組、肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組，轉染pcDNA或pcDNA-GAS5的PC12細胞氧糖剝奪4 h后，用含25.0 μg/mL肉蓯蓉總苷的無血清DMEM培養基復氧復糖20 h。細胞轉染采用脂質體轉染法，按照Lipofectamine 2000使用說明進行。

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 調整細胞密度至1×106/mL后接種于96孔板，每孔100 μL，貼壁后每孔加入10 μL CCK-8工作液，培養2 h后采用酶標儀在450 nm波長處讀取各孔光密度(OD)值，以OD值表示細胞活力。

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 預冷磷酸鹽緩沖液洗滌各組細胞，1×結合緩沖液重懸后，向100 μL細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL PI室溫避光染色15 min，通過流式細胞儀分析細胞凋亡情況。早期凋亡(Annexin V+/PI-)和晚期凋亡(Annexin V+/PI+)之和表示細胞凋亡率。

2.5 Western blot檢測pro-caspase3和cleaved-caspase3表達 用RIPA緩沖液裂解各組細胞總蛋白，檢測蛋白濃度后，取等量蛋白上樣至各孔進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，并濕轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂牛奶封閉，特異性一抗溶液4 ℃孵育過夜，次日加二抗室溫孵育2 h，使用化學發光試劑顯影，采用Image J軟件對目的條帶灰度進行定量分析。

2.6 試劑盒檢測TNF-α、IL-6水平 收集各組細胞培養液，3 000 r/min離心10 min后取上清液。按照大鼠TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒步驟加入待檢樣品(標準品)、檢測抗體、底物，終止反應后，15 min內采用酶標儀檢測各孔OD450 nm值，根據標準品繪制標準曲線，按照方程計算上清液中TNF-α、IL-6水平。

2.7 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測lncRNAGAS5表達 使用TRIzol試劑分別提取各組細胞總RNA，取2 μg總RNA逆轉錄為cDNA，按照SYBR-Green Master Mix說明書進行RT-qPCR擴增。GAS5正向引物5′-TGGTTCTGCTCCTGGTAACG-3′，反向引物5′-AGGATAACAGGTCTGCCTGC-3′；GAPDH正向引物5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGA-3′，反向引物5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3′。以GAPDH作為內參，2-ΔΔCT法對lncRNAGAS5相對表達進行分析。

3 結果

3.1 肉蓯蓉總苷對神經細胞缺血再灌注損傷的影響 與對照組比較，I/R組細胞活力、pro-caspase3蛋白表達降低，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細胞活力、pro-caspase3蛋白表達升高，凋亡率、cleaved-caspase3蛋白表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 肉蓯蓉總苷對神經細胞缺血再灌注損傷的影響

3.2 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞炎癥因子水平的影響 與對照組比較，I/R組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表2。

3.3 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞lncRNAGAS5表達的影響 與對照組比較，I/R組細胞lncRNAGAS5表達升高(P<0.05)；與I/R組比較，肉蓯蓉總苷中、高劑量組細胞lncRNAGAS5表達降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性(P<0.05)，見表3。

3.4 抑制GAS5表達對神經細胞缺血再灌注損傷及炎癥因子水平的影響 與si-NC組比較，si-GAS5組細胞活力、pro-caspase3蛋白表達升高，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達及細胞上清液中TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05)，見圖2、表4。

表2 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞炎癥因子水平的影響

表3 肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞lncRNA GAS5表達的影響

表4 抑制GAS5表達對神經細胞缺血再灌注損傷及炎癥因子水平的影響

3.5 過表達GAS5逆轉肉蓯蓉總苷對神經細胞缺血再灌注損傷的影響 與肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組比較，肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組細胞活力、pro-caspase3蛋白表達降低，凋亡率和cleaved-caspase3蛋白表達升高(P<0.05)，見表5、圖3。

3.6 過表達GAS5逆轉肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞中炎癥因子水平的影響 與肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA組比較，肉蓯蓉總苷高劑量+pcDNA-GAS5組細胞上清液中TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05)，見表6。

表5 過表達GAS5逆轉肉蓯蓉總苷對神經細胞缺血再灌注損傷的影響

表6 過表達GAS5逆轉肉蓯蓉總苷對缺血再灌注損傷神經細胞中炎癥因子的影響

4 討論

腦缺血損傷是世界范圍內僅次于心血管疾病和癌癥的常見死亡原因，研究顯示，即使短暫性腦缺血也可導致海馬區錐體遲發性神經元死亡，甚至誘發認知缺陷，嚴重影響患者生活質量[8]。因此，尋找有效的策略抑制神經細胞缺血再灌注損傷十分重要。

肉蓯蓉總苷是肉蓯蓉的主要活性成分，由咖啡酸、糖基和苯乙醇苷元3部分組成，具有較好的缺血再灌注保護作用。Yu等[9]研究發現，單側注射苯乙醇苷類化合物能縮小大鼠心臟梗死面積，降低心肌組織中抗凋亡蛋白表達，并抑制心肌細胞凋亡。Wang等[10]研究發現，肉蓯蓉總苷治療能降低大腦中動脈閉塞-再灌注大鼠神經功能缺損評分和梗塞體積，促進血管生成和神經重塑，提高腦組織抗氧化活性，并有效維持血腦屏障的完整性。此外，肉蓯蓉總苷亦可提高大鼠腎組織X-染色體連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)表達，減少腎臟細胞凋亡，保護大鼠腎臟免受缺血再灌注損傷[11]。本研究發現，中、高劑量肉蓯蓉總苷可提高細胞活力，降低缺血再灌注誘導的細胞凋亡，并呈劑量依賴性。caspase-3是內源線粒體途徑和外源性死亡受體凋亡途徑caspase級聯反應的終極效應因子，caspase-3的激活可切割DNA，導致細胞形態特征改變，引起細胞凋亡。本研究發現，肉蓯蓉總苷能降低缺血再灌注誘導神經細胞cleaved-caspase3表達，提高pro-caspase-3表達，與其抗凋亡作用一致。糖氧剝奪再復糖復氧實驗除導致細胞活力降低、促凋亡因子表達和線粒體功能障礙外，嚴重的炎癥反應對神經元細胞凋亡亦有促進作用[12]。本研究顯示，肉蓯蓉總苷能降低缺血再灌注誘導細胞上清液中促炎因子TNF-α和IL-6水平，與由淑萍等[13]研究相類似。以上研究表明，肉蓯蓉總苷通過提高細胞活力，減輕缺血再灌注誘導的細胞凋亡和炎癥反應進而對神經細胞缺血再灌注損傷具有保護作用。

lncRNAGAS5在腫瘤復發轉移、心肌缺血再灌注損傷、腦卒中等病理生理過程中具有調節作用[14-15]。Wu等[16]研究顯示，lncRNAGAS5過表達促進缺氧復氧暴露的心肌細胞凋亡，下調其表達可改善心肌細胞缺血再灌注損傷。Zhang等[17]研究表明，lncRNAGAS5能夠增強神經元糖酵解反應，加劇缺血再灌注誘導神經元細胞凋亡，抑制lncRNAGAS5可防止腦缺血再灌注損傷，改善整體神經功能。此外，Zhao等[18]指出抑制lncRNAGAS5表達對新生兒缺氧/缺血性腦損傷具有潛在治療作用。本研究顯示，肉蓯蓉總苷干預后缺血再灌注誘導的細胞中lncRNAGAS5表達降低。進一步研究顯示，抑制lncRNAGAS5表達可減輕缺血再灌注誘導的細胞毒性和凋亡，降低炎癥反應，與肉蓯蓉總苷保護作用一致。而過表達lncRNAGAS5則逆轉肉蓯蓉總苷對缺血再灌注誘導的細胞活力、凋亡、炎癥反應以及pro-caspase-3和cleaved-caspase3蛋白的影響，證實肉蓯蓉總苷通過下調lncRNAGAS5進而對神經細胞缺血再灌注發揮保護作用。

綜上所述，本研究證實肉蓯蓉總苷通過下調lncRNAGAS5表達促進細胞活力，抑制細胞凋亡和炎癥反應，進而對神經細胞缺血再灌注損傷發揮保護作用，這豐富了肉蓯蓉總苷在神經細胞缺血再灌注損傷中的調控機制，為缺血性腦損傷治療提供了新的方向。