基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討六味地黃丸延緩衰老的活性成分與作用機(jī)制

楊華杰， 謝媛媛， 魏惠珍， 呂 尚， 金浩鑫， 饒 毅*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；2.中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西 南昌 330000；3.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510000)

中醫(yī)認(rèn)為，隨著年齡生長，腎氣不足，進(jìn)而導(dǎo)致后天之本的脾胃功能虛弱，氣血化生不足，臟腑失于滋養(yǎng)，進(jìn)一步加劇衰老[1]；西醫(yī)認(rèn)為，在機(jī)體衰老過程中固有免疫和獲得性免疫功能改變，機(jī)體中的促炎因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α等水平升高，會(huì)引起機(jī)體的低度炎癥狀態(tài)[2]，機(jī)體長期處于這種慢性促炎性反應(yīng)升高的狀態(tài)被稱為炎性衰老[3]，并且機(jī)體內(nèi)炎性水平高低被視為決定機(jī)體衰老速率及壽命的關(guān)鍵因素[4]。Fuente等[5]報(bào)道，由自由基堆積誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起機(jī)體內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式的產(chǎn)生及細(xì)胞因子的釋放，過量產(chǎn)生的自由基可作用于細(xì)胞膜，造成蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能損傷、DNA突變等，最終引起衰老和死亡。同時(shí)，衰老會(huì)引起自由基代謝穩(wěn)態(tài)失衡，并伴隨炎癥穩(wěn)態(tài)失衡，而炎癥又可導(dǎo)致衰老，自由基-炎癥-衰老構(gòu)成了關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜的惡性循環(huán)[6]。

六味地黃丸來源于《小兒藥證直訣》，是治療腎陰虧損的主要中藥方劑，臨床應(yīng)用歷史有上千年[7-8]，具有抗炎、降血糖、抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、延緩衰老、防癌抗癌等作用[9-10]，療效顯著，安全性高。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[11]，對六味地黃丸活性成分、治療靶點(diǎn)、信號(hào)通路加以預(yù)測，探討其作用機(jī)制，并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SFP級(jí)昆明小鼠共60只，體質(zhì)量18～22 g，由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(贛)2018-0003。

1.2 儀器 酶標(biāo)儀、洗板機(jī)(美國Thermo公司)；吉爾森P型移液器(法國Gilson公司)；ABI-7300型PCR儀(美國ABI公司)；PRO200型電動(dòng)勻漿機(jī)(上海弗魯克科技發(fā)展有限公司)；CX-41型正置顯微鏡(日本Olympus公司)；SQ2125石蠟切片機(jī)、PPTHK-21B攤片機(jī)(湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司)。

1.3 試劑與藥物 六味地黃丸(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠，批號(hào)18032121)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、TNF-α、IL-1β、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)2010R)；SYBR Green PCR試劑盒(美國Thermo公司，批號(hào)K0223)；DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司，批號(hào)DP304]；增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒(×20)、D-半乳糖、蘇木素、中性樹脂(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)DA1015、420K053、H8070、G8590)；石蠟、甲醛、二甲苯、無水乙醇、30% H2O2(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)69018961、10010018、10023418、10092680、10011218)。

2 方法

2.1 潛在活性成分篩選及作用靶點(diǎn)預(yù)測 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)收集六味地黃丸全部成分。以口服生物利用度(OB)≥15%、類藥性(DL)≥0.1為篩選條件，檢索具有潛在生物活性的成分和對應(yīng)靶點(diǎn)。

2.2 衰老相關(guān)靶點(diǎn)收集 以“senile”“old”“feeble”“caducity”“senescence”“decrepit”為檢索詞，采用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，將結(jié)果合并，去除重復(fù)后得到衰老相關(guān)靶點(diǎn)。再將“2.1”項(xiàng)下活性成分作用靶點(diǎn)與上述衰老相關(guān)靶點(diǎn)合并，取交集，繪制韋恩圖。

2.3 藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 采用Cytoscape 3.5.1軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶點(diǎn)-疾病互相作用網(wǎng)絡(luò)。

2.4 KEGG通路富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，對交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析。

2.5 分組、造模與給藥 60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組，模型組，陽性組，六味地黃丸低、中、高劑量組，每組10只，除正常組外，其余各組小鼠每天腹腔注射D-半乳糖生理鹽水溶液200 mg/kg，連續(xù)8周，以制備急性衰老模型。同時(shí)，陽性組小鼠每天灌胃給予45.5 mg/kg維生素E溶液，六味地黃丸低、中、高劑量組小鼠每天灌胃給予0.78、1.56、3.12 g/kg相應(yīng)藥液，模型組、正常組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水。

2.6 抗氧化能力指標(biāo)及促炎細(xì)胞因子水平檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清過氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)水平，以及血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β水平。

2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測端粒長度 采用DNA提取試劑盒提取小鼠腦組織DNA，按SYBR Green PCR試劑盒操作說明進(jìn)行擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，引物由上海捷瑞生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成，以Tel-1為參照，正向5′-GGTTTTTGAGGGTGAGGGTGAGGGTGAGGGTG AGGGT-3′，反向5′-TCCCGACTATCCCTATCCCTATCCCT ATCCCTATCCCTA-3′；以AT1為參照，正向5′-ACGTGT TCTCAGCATCGACCGCTACC-3′，反向5′-AGAATGATAAG GAAAGGGAACAAGAAGCCC-3′，具體操作按照熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min；60 ℃擴(kuò)增15 s 40個(gè)循環(huán)，采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行處理分析。

2.8 免疫組化法檢測NF-κB p65表達(dá) 二甲苯脫蠟，梯度乙醇置換二甲苯至水，抗原修復(fù)20 min，PBS洗3次，每次3 min，3% H2O2孵育10 min，羊血清封閉30 min，一抗在4 ℃下孵育過夜，二抗在37 ℃下孵育60 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸乙醇分化，在顯微鏡下觀察以控制染色程度，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

3 結(jié)果

3.1 六味地黃丸潛在活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共收集六味地黃丸化學(xué)成分508種，以O(shè)B≥15%、DL≥0.1為篩選條件，得到193種潛在活性成分，見表1，可知作用靶點(diǎn)共4 221個(gè)，去除重復(fù)后最終得到481個(gè)。另外，課題組前期還發(fā)現(xiàn)了42種潛在活性成分，見表2。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫中潛在活性成分

續(xù)表1

續(xù)表1

表2 課題組前期發(fā)現(xiàn)的潛在活性成分

3.2 衰老相關(guān)靶點(diǎn) 在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫中共收集疾病靶點(diǎn)12 725個(gè)，去除重復(fù)后有8 780個(gè)，將其與“3.1”項(xiàng)下潛在活性成分的作用靶點(diǎn)合并，取交集，得到交集靶點(diǎn)431個(gè)，見圖1。

3.3 藥物-活性成分-疾病-靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò) 由圖2可知，六味地黃丸延緩衰老的作用是通過組方藥材所含熊果酸、丹皮酚、牡丹皮苷C、mudanoside B、亞麻油酸、山柰酚、decaffeoylverbascoside等47種潛在活性成分協(xié)同發(fā)揮所致。

3.4 KEGG通路分析 共得到181條KEGG通路，對P值排名前20者進(jìn)行可視化分析，結(jié)果見圖3，可知主要富集于癌癥信號(hào)通路和炎癥信號(hào)通路。在癌癥發(fā)展早期階段，細(xì)胞增殖的異常激活導(dǎo)致支持正常細(xì)胞DNA復(fù)制的核苷酸缺乏，最終造成DNA損傷[51]，之后又會(huì)啟動(dòng)核因子(NF)-κB信號(hào)通路，引起促炎介質(zhì)的基因表達(dá)增加，而六味地黃丸可能通過作用于癌癥及炎癥相關(guān)作用通路來發(fā)揮延緩衰老的作用。

3.5 六味地黃丸對小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清SOD、GSH-Px活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.01)。與模型組比較，六味地黃丸中劑量組小鼠血清SOD活性升高(P<0.01)；六味地黃丸高劑量組小鼠血清MDA水平降低(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性升高(P<0.01)；陽性組小鼠血清SOD活性升高(P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見表3。

3.6 六味地黃丸對小鼠腦組織端粒長度的影響 與正常組比較，模型組小鼠腦組織端粒長度縮短(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸高劑量組小鼠腦組織端粒長度增加(P<0.01)，見表4。

3.7 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸中、高劑量組及陽性組小鼠血清、腦組織、腎組織中TNF-α、IL-1β表達(dá)降低(P<0.05，P<0.01)，見表5～6。

3.8 六味地黃丸對小鼠腦組織NF-κB p65表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠腦組織NF-κB p65表達(dá)升高(P<0.01)；與模型組比較，六味地黃丸中、高劑量組及陽性組小鼠腦組織NF-κB p65表達(dá)降低(P<0.01)，見圖4、表7。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，熊果酸、丹皮酚、牡丹皮苷C等47種成分為延緩衰老的潛在活性成分。熊果酸可以通過上調(diào)老年大鼠白色脂肪組織(eWAT)中的p-Akt、p-Akt與Akt的比值、總蛋白和細(xì)胞膜上GLUT4的表達(dá)，從而抑制NF-κB和促炎細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β)的表達(dá)，發(fā)揮改善老年大鼠脂肪組織胰島素抵抗的作用[52]。丹皮酚可通過調(diào)節(jié)抗氧化Nrf2通路，以及抗衰老p16/ld-1和p53/

表3 六味地黃丸對小鼠血清SOD、GSH-Px活性及MDA水平的影響

表4 六味地黃丸對小鼠腦組織端粒長度的影響

p21通路來逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5細(xì)胞氧化和衰老，表明丹皮酚具有較強(qiáng)的抗衰老作用[53]。此外，山柰酚可以下調(diào)ROS/FoxO信號(hào)途徑的表達(dá)，引起后者轉(zhuǎn)錄抗氧化基因和DNA損傷修復(fù)基因水平降低，從而保護(hù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞免受氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[54]。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，六味地黃丸活性成分作用靶點(diǎn)主要富集在MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路以及NF-κB信號(hào)通路，其中MAPK和PI3K通路的差異性最為顯著，且已有文獻(xiàn)報(bào)道六味地黃丸可作用于以上2條通路[55-60]。本研究選擇作為MAPK和PI3K信號(hào)通路下游的NF-κB通路[61-62]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明六味地黃丸可通過干預(yù)小鼠NF-κB p65入核，從而影響NF-κB信號(hào)通路的激活。

表5 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織TNF-α表達(dá)的影響

表6 六味地黃丸對小鼠血清、腦組織、腎組織IL-1β表達(dá)的影響

表7 六味地黃丸對小鼠腦組織NF-κB p65表達(dá)的影響

衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為隨著人體衰老，機(jī)體內(nèi)自由基與自由基清除系統(tǒng)的平衡遭到破壞，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能嚴(yán)重受損以至衰老、死亡，因而增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，加強(qiáng)自由基的清除，可有效延緩細(xì)胞衰老[63]。體內(nèi)自由基攻擊，造成的端粒DNA損傷和基因組不穩(wěn)定會(huì)加速細(xì)胞衰老[64]。本研究結(jié)果表明，與正常組比較，模型組小鼠氧自由基清除能力下降，同時(shí)細(xì)胞端粒長度縮短，給藥后上述現(xiàn)象改善，表明六味地黃丸可能通過增強(qiáng)抗氧化和自由基清除能力從而減少端粒DNA損傷，從而發(fā)揮延緩衰老的作用。

Jurk等[65]發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠的慢性低度炎癥可以誘導(dǎo)早衰，推測是由于因含有氧化化學(xué)活性分子造成的DNA損傷而導(dǎo)致的端粒變短效應(yīng)的增強(qiáng)。因此，控制促炎因子間的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與協(xié)同作用就顯得尤為重要[66]。TNF-α和IL-1β作為促炎細(xì)胞因子，在生理?xiàng)l件下水平較低，但在慢性炎性疾病狀態(tài)下水平就會(huì)增加[67-68]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組小鼠端粒變短效應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)參與慢性炎癥反應(yīng)的促炎因子水平增加，給藥后上述現(xiàn)象改善，表明六味地黃丸可能通過抑制端粒變短效應(yīng)從而減緩老化細(xì)胞積累、干預(yù)促炎因子表達(dá)和NF-κB p65的入核來影響NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，六味地黃丸可能通過降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)代謝產(chǎn)物以及增強(qiáng)自由基清除能力，從而減少端粒DNA損傷、抑制端粒變短效應(yīng)，進(jìn)而減緩老化細(xì)胞積累、干預(yù)促炎因子表達(dá)和NF-κB p65的入核來影響NF-κB信號(hào)通路的激活，最終發(fā)揮延緩衰老的作用。