基于網絡藥理學和動物實驗探討桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機制

梁景輝， 胡恩宜， 朱 閩， 買鵬宇， 張澤朝， 葉 斌， 時 雪， 彭 杰，葉沛仁

(1.欽州市中醫醫院，廣西 欽州 535000；2.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200；3.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，廣西 南寧 530011)

不育癥是指育齡夫婦同居1年以上，性生活規律，沒有采取任何避孕措施，由于男方原因導致女方未能受孕[1]。世界衛生組織統計育齡夫婦中不孕不育占比為15%，其中約有50%是因男性因素造成的[2]。相關研究表明少精子癥及弱精子癥是導致不育癥的常見致病因素，兩者可單獨或者合并出現[3]。現代醫學對不育癥的發病機制尚未完全明確，臨床治療沒有特異性的藥物，主要以絨毛膜促性腺激素、抗氧化制劑、抗生素等治療為主，雖然取得一定的臨床療效，但長期使用會伴隨諸多不良反應發生[4]。

男性不育屬于中醫學“無子”“艱嗣”等范疇，中醫認為該病以本虛標實為病證特點，既有臟腑虛損之本，又有濕熱瘀滯為標，治療上以補腎益精為基礎[5]。桂藥生精膠囊是廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院院內制劑，由淫羊藿、菟絲子、覆盆子、金櫻子、車前子、天冬、麥冬、女貞子、枸杞子、桑椹子、黃芪、黨參、紅參、紅花、甘草15味中藥組成，具有溫腎益氣、滋腎生精的功效。臨床研究表明，桂藥生精膠囊治療不育癥的總有效率為87.50%，能有效提高精子活力、活率及頂體酶活性等[6-7]，但對其具體的作用機理尚需要進一步的探討。

網絡藥理學是通過研究藥物活性成分及其相關靶點，并在系統生物學理論的基礎上，探討藥物-作用靶點、疾病-治療靶點之間聯系的方法[8]。本文通過網絡藥理學方法首次對桂藥生精膠囊治療不育癥的分子機制進行全面的解析，并根據結論采用動物實驗加以驗證，旨為后續不育癥的臨床治療及實驗研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學

1.1.1 有效成分及靶點篩選 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為篩選標準，檢索桂藥生精膠囊組方藥材(淫羊藿、菟絲子、覆盆子、金櫻子、車前子、天冬、麥冬、女貞子、枸杞子、桑椹子、黃芪、黨參、紅參、紅花、甘草)有效成分，并在TCMSP數據庫中獲取有效成分的對應靶點，通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)對靶點信息進行人源基因轉換。

1.1.2 疾病靶點篩選 以“male infertility”為關鍵詞，檢索Genecards數據庫(https://www.genecards.org/)、人類孟德爾遺傳數據庫OMIM(https://omim.org/search/advanced/geneMap)中不育癥靶點，刪除重復靶點基因，將所有靶點基因導入Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)進行人源基因轉換。

1.1.3 藥物疾病共同靶點基因的篩選及韋恩圖構建 將藥物、疾病靶點基因導入Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，篩選出藥物、疾病共同含有的靶點取交集，繪制韋恩圖。

1.1.4 蛋白互作網絡構建和核心靶點篩選 將藥物-疾病的共同靶點基因數據導入String(https://string-db.org)在線數據庫，設定物種為“Homosapiens”，篩選置信度>0.90，獲取所有蛋白-蛋白相互作用(PPI)關系構建網絡可視化，并導入Cytoscape 3.8.0進行數據分析，通過拓撲結構分析得出核心的藥物靶點，篩選度值(Degree)、介數中心性(Betweenness centrality)、節點緊密度(Closeness)同時大于中位數。

1.1.5 基因功能和生物通路富集分析 采用R語言軟件包，應用Bioconductor(www.bioconductor.org/)對潛在作用靶點進行基因本體(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析，設定閾值P<0.05。GO分析包括生物過程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)，KEGG分析側重于桂藥生精膠囊干預不育癥的信號通路。

1.2 動物實驗

1.2.1 動物 SPF級8周齡雄性SD大鼠42只，體質量(180±20)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物使用許可證號SYXK(桂)2019-0004。大鼠飼養于廣西中醫藥大學壯醫藥學院重點實驗動物房，溫度(25±2)℃，相對濕度50%～60%，分籠架式喂養，清潔飲水，自由攝食，1周更換2次墊料。

1.2.2 試劑、藥物與儀器 桂藥生精膠囊(批號Z01060147，廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院)。注射用環磷酰胺(批號H32020857)購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司；纈沙坦膠囊(批號H20040217)購自北京諾華制藥有限公司。兔抗人Bcl-2(批號26593-1-AP)、Bax(批號50599-2-Ig)、caspase-9(批號10380-1-AP)、caspase-3多克隆抗體(批號19677-1-AP)購自武漢三鷹生物技術有限公司；酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物(批號PV-6000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。自動組織脫水機(型號ASP300S)、一體式石蠟包埋機(型號EG1160)、轉輪切片機(型號RM2235)購自德國Leica公司；光學顯微鏡(型號BX53F)購自日本Olympus公司。

1.2.3 分組與模型制備 大鼠適應性喂養7 d后，隨機抽取7只作為空白組，其余35只作為造模組，空白組腹腔注射生理鹽水，造模組腹腔注射環磷酰胺(40 mg/kg)，連續5 d[9-10]。造模成功后，將造模大鼠隨機分為模型組、陽性組及桂藥生精膠囊低、中、高劑量組，每組7只。

1.2.4 干預治療 大鼠造模結束后第1天開始干預給藥，陽性組給予纈沙坦膠囊灌胃，劑量為1.44 mg/mL(相當于人臨床用藥劑量)；桂藥生精膠囊各劑量組給予桂藥生精膠囊灌胃，低、中、高劑量分別為28.5、57、114 mg/mL(分別相當于人臨床每天推薦用量的0.5、1、2倍)，每天1次，每次1 mL，連續4周，每周對大鼠體質量進行復測，以此調整藥物劑量；空白組、模型組灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.5 精子參數檢測 末次給藥24 h后處死大鼠，采用擴散法對附睪內精子進行檢測[11]，無菌條件下摘取左側附睪，置于5 mL(37 ℃預熱)PBS緩沖液中，剪碎后在37 ℃恒溫水浴箱中孵育2 min讓精子充分游離出來，滴加到血球計數板上，在光學顯微鏡下進行觀察。參照世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第五版)[12]，從精子密度、運動精子百分率(PR+NP)、前向運動精子百分率(PR)3個方面進行數據記錄。

1.2.6 睪丸組織病理檢測 大鼠睪丸組織于中性甲醛固定24 h后脫水，石蠟包埋、切片，脫蠟水洗，蘇木精-伊紅(HE)染色，分化，脫水透明，封片，在光鏡下觀察，每組隨機選取10個視野拍照(×200)。

1.2.7 免疫組織化學(IHC)染色法檢測核心靶點表達 大鼠睪丸組織切片脫蠟至水，阻斷修復，一抗孵育稀釋Bcl-2(1∶400)、Bax(1∶1 200)、caspase-9(1∶200)、caspase-3(1∶300)抗體，二抗孵育，DAB顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下觀察，每組隨機選取10個視野拍照(×400)。鏡下可觀察到陽性表達呈深褐色沉積，對陽性細胞進行計數，陽性表達率=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

2 結果

2.1 桂藥生精膠囊有效成分及靶點篩選 共得到264種有效成分，其中淫羊藿23種，菟絲子10種，覆盆子6種，金櫻子6種，車前子7種，天冬7種，麥冬20種，女貞子8種，枸杞子36種，桑椹子4種，黃芪17種，黨參17種，紅參3種，紅花17種，甘草83種，見表1。再搜集上述有效成分對應的靶點，使用Uniprot數據庫對靶點進行人源基因轉換，去重合并后得到509個靶點。

2.2 藥物-疾病共同靶點 經去重合并后，得到疾病靶點4 171個，利用Venny 2.1對藥物靶點與疾病靶點進行映射，得到交集靶點261個，見圖1。

表1 桂藥生精膠囊有效成分(OB值前20位)

2.3 PPI網絡與核心靶點 利用String數據庫對261個藥物-疾病交集靶點進行PPI網絡構建，見圖2，采用拓撲結構分析得到核心靶點97個，包括AKT1、Bcl-2、IL-6、VEGFA、MAPK3、TNF、caspase-3、EGFR、ESR1、PTGS2、STAT3、Bax、Fos、MAPK1、CXCL8、MMP-9、IL-17A、IGF1、NOS3、caspase-9、IL-1B、STAT1、CRP、LEP、CYCS、CCL2、CD44、caspase-8、HIF-1ɑ、Fas等。

2.4 GO功能富集分析 將261個藥物-疾病交集靶點經R語言處理后進行GO功能富集分析，選取生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)顯著性排名前10位者構成GO富集條形圖，見圖3。由此可知，BP富集涉及細胞對化學應激的反應(cellular response to chemical stress)、氧化應激反應(response to oxidative stress)、對營養水平的反應(response to nutrient levels)等；CC富集涉及膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomaini)、膜區(membrane region)等；MF富集涉及四吡咯結合(tetrapyrrole binding)、黃素腺嘌呤二核苷酸結合(flavin adenine dinucleotide binding)、血紅素結合(heme binding)等。

2.5 KEGG通路富集分析 將藥物-疾病交集靶點進行KEGG通路富集分析，共得到186條信號通路，選取顯著性前30位者構成KEGG富集圖，見圖4，相關通路包括糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、細胞凋亡(apoptosis)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、乙型肝炎(hepatitis B)、細胞衰老(cellular senescence)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、內分泌抵抗(endocrine resistance)、癌癥中的蛋白多糖(proteoglycans in cancer)、腫瘤壞死因子信號通路(proteoglycans in cancer)等。

2.6 細胞凋亡通路 圖4顯示，細胞凋亡是桂藥生精膠囊治療不育癥顯著性最高的通路之一，從中獲取相關富集靶點作用機制圖，見圖5，發現可擊中24個靶點，包括Bcl-2、BIRC5、PARP1、caspase-3、RAF1、MAPK1、MCL1、Bax、FOS、caspase-9、caspase-8、TNF、FAS、CYCS、CHUK等。另外，桂藥生精膠囊對不育癥的治療作用可能是通過細胞凋亡途徑實現的，而Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3也是拓撲結構分析得到的核心靶點，故采用動物實驗對該凋亡靶點進行驗證。

2.7 桂藥生精膠囊對大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3表達的影響 圖6、表2顯示，與空白組比較，模型組Bcl-2陽性表達率降低(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽性表達率升高(P<0.05)；與模型組比較，陽性組和桂藥生精膠囊各劑量組Bcl-2陽性表達率升高(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽性表達率降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性；與陽性組比較，桂藥生精膠囊中、高劑量組Bcl-2陽性表達率升高(P<0.05)，Bax、caspase-9、caspase-3陽性表達率降低(P<0.05)。桂藥生精膠囊高劑量組Bcl-2陽性表達率與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.8 桂藥生精膠囊對大鼠睪丸組織形態的影響 圖7顯示，桂藥生精膠囊各劑量組大鼠睪丸組織結構較模型組與陽性組有明顯改善，生精小管形態趨向規則，基底膜增厚，纖維肌細胞與支持細胞數量分布均勻，精原細胞與精母細胞排列趨于整齊、層數增多，細胞外膜破損可見修復，精子細胞與精子數量增多，微血管供血改善，炎性細胞浸潤減少；桂藥生精膠囊高劑量組大鼠睪丸組織形態結構未見明顯病理改變，改善程度最明顯，與空白組比較無明顯變化。

表2 各組大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3陽性表達率比較

2.9 桂藥生精膠囊對大鼠精子參數的影響 表3顯示，與空白組比較，模型組精子密度、精子活力降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性組和桂藥生精膠囊各劑量組精子密度、精子活力升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性；桂藥生精膠囊各劑量組精子密度及中、高劑量組精子活力高于陽性組(P<0.05)；桂藥生精膠囊高劑量組精子密度與精子活力及桂藥生精膠囊中劑量組PR與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠精子參數水平比較

3 討論

本研究從桂藥生精膠囊中獲得異黃烷酮、酸漿苦素A、甘草醇等264種有效成分，大多為黃酮類、多糖類、生物堿類等化合物。有研究表明，黃酮類化合物能調控精子細胞內的Ca2+濃度，提高性激素水平，改善機體氧化應激反應，促進精子細胞獲能，提高精子活力[13]。多糖類化合物能增強體內激素合成蛋白的水平，調節線粒體功能，改善睪丸微環境與炎癥細胞因子水平，提高精子的質量[14-15]。拓撲結構分析得到核心靶點97個，其中部分核心靶點已有研究證實對不育癥有調控作用。楊晶等[16]發現調治天癸方能上調不育癥大鼠生精細胞Bcl-2表達，下調Bax表達，減少細胞凋亡。樊衛民等[17]發現不育癥患者精漿中TNF-ɑ與IL-6水平升高，可引起精子形態和功能的改變。Zhang等[18]發現麒麟丸可通過抑制caspase-9、caspase-3蛋白的表達，減少不育癥大鼠睪丸組織凋亡，從而改善大鼠精子質量和睪丸損傷。Wu等[19]研究發現白樺酸可通過降低STAT3、JAK2、Bax表達，上調Bcl-2表達，修復T-毒素所致的睪丸氧化損傷。Xiao等[20]采用束縛應激誘導不育癥小鼠模型，結果發現小鼠生精細胞Fas、FasL表達升高。

GO功能富集涉及的生物學過程均體現在藥物有效成分的發揮及靶點所涉及的通路中，而KEGG富集得到信號通路186條，主要涉及糖尿病并發癥AGE-RAGE信號通路、細胞凋亡、IL-17信號通路等。AGE-RAGE信號通路可引起大量促炎細胞因子、黏附分子、生長因子的表達和釋放，降低細胞增殖活性與血管通透性，最終引起慢性細胞活化和微血管病變，這可能是造成睪丸組織損傷的重要原因之一[21]。細胞凋亡是由多因子或蛋白參與的復雜的生理性死亡過程，其過度凋亡可導致線粒體外膜通透性改變，最終影響精子的發育與成熟[22]。IL-17信號通路可誘導多種促炎細胞因子的產生，募集、活化中性粒細胞，從而造成精子DNA損傷及斷裂，影響男性的生育能力[23]。

研究表明，細胞凋亡程序在不育癥發生和進展中起重要作用，其中Bcl-2家族與caspase家族是細胞凋亡最重要的基因家族[24-25]。Bcl-2家族中Bcl-2蛋白具有抑制多種凋亡蛋白激活、阻斷氧化破壞、抑制細胞色素表達等作用，Bax蛋白具有激活凋亡蛋白、促進線粒體裂解等作用[26]。caspase-3蛋白是caspase級聯反應的最終執行因子，caspase-9蛋白可激活caspase-3引起細胞核酸斷裂，最終導致細胞凋亡[27]。在病理狀態下，Bcl-2和Bax的失衡會激活caspase-9及caspase-3蛋白，最終導致過度凋亡，睪丸組織毒性增強，導致精子數量減少、精子活動力下降[28]。Salama等[29]發現纈沙坦能介導不育癥大鼠睪丸組織的氧化應激反應，降低對線粒體膜電位的破壞，有效改善大鼠的精子質量、性激素水平，提高Bcl-2表達，降低Bax、caspase-3表達，通過抑制凋亡信號通路減少睪丸組織凋亡，逆轉環磷酰胺造成的睪丸毒性。纈沙坦屬于血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，對男性生育能力有正面影響[30]，因此本實驗中采用纈沙坦膠囊作為陽性對照，結果證實桂藥生精膠囊可參與細胞凋亡通路，上調不育癥大鼠睪丸組織Bcl-2表達，下調Bax、caspase-9、caspase-3表達，改善睪丸病理損傷，提高大鼠精子密度與活力，結果優于陽性組，并且具有明顯的量效關系，這可能是桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機制之一。

綜上所述，桂藥生精膠囊是通過多成分、多靶點、多通路共同調控來達到治療不育癥的目的。但本實驗僅從細胞凋亡通路中核心靶點Bcl-2、Bax、caspase-9、caspase-3表達來驗證桂藥生精膠囊治療不育癥的作用機制，未對細胞凋亡的其他相關靶點及其他信號通路進行研究探討，因此完整的調控機制仍需今后進一步的研究來驗證說明。