基于網絡藥理學和動物實驗探討腦泰方治療腦缺血的作用機制

賀 旭， 宋禎彥， 王珊珊， 劉曉丹， 葛金文*

(1.湖南中醫藥大學中西醫結合學院，湖南 長沙 410208；2.益陽醫學高等專科學校解剖教研室，湖南 益陽 413000)

腦卒中是一種急性腦血管疾病，其中缺血性腦卒中占到 60%～70%。缺血性中風屬中醫“中風”范疇，其病機非常復雜，氣血兩虛是缺血性中風的主要病機[1]。《醫林改錯》記載，“虧損元氣，是其本源”“元氣既虛，必不能達于血管，血管無氣，必停留而瘀”，提出“氣虛血瘀”學說[2]。因此，缺血性中風的主要病機為“氣虛血瘀”，其主要治則便是益氣活血。

王清任根據益氣活血的治則創立補陽還五湯，并以該法確立得到中藥復方腦泰方，由黃芪、川芎、地龍和僵蠶(8∶2∶3∶3)構成，主要功效補氣活血、化瘀通絡，現已用于腦缺血急性期的治療，且取得了較好的臨床效果。課題組前期研究表明，腦泰方的作用機制可能是通過抗血小板活化[3]、抗血栓[4]、抑制神經元的凋亡[5]、抗炎性作用[6]及上調膜鐵轉運輔助蛋白，減少腦鐵沉積[7]起神經保護作用，但其在腦缺血疾病中的藥理作用尚未完全闡明。本研究通過多個數據庫聯用檢索和文獻挖掘，篩選腦泰方的主要活性成分并進行成分靶點預測，分析活性成分-作用靶點-疾病之間的作用關系，并對靶點基因功能及信號通路進行分析，構建腦泰方治療缺血性腦中風的成分-靶點-通路網絡，進行網絡拓撲學分析，從而揭示其作用的分子機制，為腦泰方在腦缺血疾病中的臨床應用和進一步研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 腦泰方活性成分的收集和分析 腦泰方由黃芪、川芎、地龍、僵蠶組成，臨床水煎服用，該方劑化合物信息分析依托于中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中藥分子機制的生物信息學分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)、中藥信息數據庫(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid)。設置口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18，對上述4味中藥所含的每個化合物進行篩選，無藥物動力學參數的化合物通過查閱文獻進行篩選。最后通過Pubchem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/) 查詢篩選出的化合物結構式，并獲得化合物的SMILES表達式。

1.2 腦泰方活性成分的靶點獲取 采用TCMS、SEA (http://sea.bkslab.org)、SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫，根據化合物結構相似性和分子對接特性進行預測，并結合相關文獻進行補充。腦泰方活性成分的靶點預測分數閾值設置≥0.6[8]，使用UniProt (http://www.uniprot.org/)進行除重及標準化命名。

1.3 “腦缺血”靶點獲取 在Drugbank(https://www.drugbank.ca/)、TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)、DisGeNET (https://www.disgenet.org/)數據庫中輸入關鍵詞“cerebral ischemia”，獲取腦缺血疾病的相關靶點，然后將腦泰方的預測靶點映射到腦缺血疾病相關靶點中，以獲取腦泰方治療腦缺血的潛在作用靶點。

1.4 可視化網絡構建 利用Cytoscape v3.6.1軟件構建活性成分-靶點-腦缺血疾病可視化網絡圖，使用在線蛋白相互作用的檢索和預測數據庫STRING(https://string-db.org/)構建腦泰方抗腦缺血潛在靶點的蛋白與蛋白相互作用(PPI)網絡，選擇系統默認分值score≥0.4，并使用Cytoscape v3.6.1軟件繪制靶蛋白PPI網絡圖。

1.5 GO、KEGG富集分析 將“1.4”項下腦泰方治療腦缺血的蛋白-蛋白相互作用重要拓撲模塊中的靶點導入在線基因功能富集工具DAVID 6.8 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/)，以人類基因為背景，P<0.05、FDR(錯誤發現率)<0.05為標準，對主要活性成分和腦缺血的共同基因進行GO富集分析。同時，將這些靶點導入KEGG數據庫(https://www.genome.jp/kegg/)查看對應的通路圖并分類，利用Omicshare (www.omicshare.com/tools)，以P<0.05、FDR<0.05為標準對通路進行富集分析，找出腦泰方發揮抗腦缺血作用的關鍵通路。

1.6 實驗驗證

1.6.1 動物 SPF級雄性SD大鼠，8周齡，體質量250～290 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(湘)2019-0004。動物房溫度保持(23±1)℃，相對濕度55%，通風良好，飼養于光照/黑暗為12 h/12 h的環境，每籠4只，自由飲水，給予標準飲食。

1.6.2 試劑與儀器 兔抗p-ERK1/2、p-CREB抗體(美國CST公司)；兔抗BDNF抗體(美國Affinity Biosciences公司)；兔抗GAPDH抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。Kopf腦立體定位儀(美國David KOPF Instruments公司)；線栓(北京西濃科技有限公司)。

1.6.3 腦泰方制備 黃芪、川芎、地龍、僵蠶均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥房，25 g川芎加80%乙醇浸泡45 min，提取2次，加醇量分別為8、6倍，提取時間為2、1.5 h，濾過，合并濾液，60 ℃真空濃縮；另取黃芪100 g、地龍37.5 g、僵蠶37.5 g 、川芎醇提后的藥渣適量，加水浸泡30 min，提取2次，每次加10倍量水，提取時間分別為2、1 h，濾過，合并濾液，真空濃縮，干燥成干浸膏，臨用時生理鹽水稀釋。前期課題組發現，1.8、0.9 g/mL腦泰方能顯著改善腦缺血大鼠的神經功能缺損體征，故本實驗選擇0.9 g/mL進行考察。

1.6.4 模型建立 采用大腦中動脈栓塞法制備局灶性腦缺血模型，大鼠腹膜腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉，仰臥位固定做手術切口，鈍性分離頸總動脈和迷走神經，微動脈夾夾閉頸總動脈的近心端，找到頸總動脈分叉處并分離頸外動脈和頸內動脈，在分叉處結扎(活結)頸外動脈，在附近剪一小口，將拴線插入到頸內動脈，深度為(18±0.5)mm，右側大腦中動脈栓塞30 min后拔出拴線，將分叉處結扎(活結)的頸外動脈手術線松開，去除近心端的微動脈夾，用簽壓住出血處止血，縫合切口；假手術組除不插入線栓外，其余步驟同模型組。

1.6.5 分組及給藥 大鼠隨機分為假手術組、模型組、腦泰方組，腦泰方組于腦缺血第1天灌胃給予9 g/kg腦泰方(0.9 g/mL)，每天1次；模型組在腦缺血第1天灌胃給予等體積0.9%生理鹽水，每天1次；假手術組不干預。當大鼠恢復意識能進行活動后，在第1、7、15天采用Longa 5級4分法進行神經功能評分[9]，在第15天后取海馬，檢測p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達。

1.6.6 免疫印跡實驗 大鼠斷頭處死，取腦并分離海馬，組織與蛋白提取劑按1∶10比例稀釋，裂解組織，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，收集上清液后測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，每個泳道上樣20 μg總蛋白，電泳分離蛋白后轉移至PVDF膜上，p-ERK1/2、p-CREB轉膜約90 min，BDNF轉膜約45 min。一抗孵育(1∶1 000)在4 ℃下過夜，1×TBST 溶液漂洗，稀釋偶聯HRP標記羊抗兔二抗 (1∶10 000)室溫孵育2 h，漂洗后采用ECL化學發光法顯影，以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析目的條帶灰度值，并計算目的蛋白相對表達。

2 結果

2.1 腦泰方活性成分篩選 共篩選出29種活性成分，另外有10種雖不符合篩選條件，但文獻[10-21]報道它們也具有相應活性，故予以補充，見表1。其中，黃芪占22種，川芎占11種，地龍占8種，僵蠶占6種，見圖1。

表1 腦泰方活性成分信息

2.2 腦泰方活性成分抗腦缺血的靶點預測和可視化網絡構建 腦泰方39種活性成分共有629個作用靶點，存在1 819個相互作用關系，其中每種活性成分都有2個以上的作用靶點，平均46.6個。從TTD、Drugbank、DisGeNET數據庫中共獲得腦缺血疾病靶點312個，本實驗將預測靶點與其相互映射，共獲取80個潛在作用靶點，見圖2。

將腦泰方39種活性成分與80個抗腦缺血的潛在靶點構建成分-靶點-疾病網絡，網絡中化合物與靶點相連的連線稱之為度(Degree)，連線越多，自由度越高，表明該節點(化合物或靶點)存在的相互作用關系越多[22]，見圖3。由此可知，具有較高自由度的靶點包括PTGS2(Degree=24)、PPARG(Degree=12)、NOS2(Degree=9)、VEGFA(Degree=6)、TNF(Degree=5)，具有較多預測靶點的有槲皮苷(M36，Degree=47)、山柰酚(M28，Degree=26)、異鼠李素(M26，Degree=17)、十八烯酸(M33，Degree=14) 等，可能是腦泰方抗腦缺血的重要藥效成分。

將80個潛在靶點構建了PPI網絡，發現包含1 190種相互作用關系，其中處于PPI網絡中心擁有較多蛋白相互作用的靶點有VEGFA(Degree=60)、TNF(Degree=59)、CREB1(Degree=57)、IL6(Degree=56)、CASP3(Degree=55)、BDNF(Degree=53)、MAPK1(Degree=43)等，提示這些蛋白可能是抗腦缺血的重要效應蛋白，見圖4。

2.3 GO、KEGG富集分析 采用DAVID 6.8數據庫對80個與腦缺血相關的靶點進行GO、KEGG富集分析，篩選排名前20個GO生物學過程分析條目，見圖5。GO富集分析結果表明，腦泰方核心作用靶點主要通過衰老、凋亡過程、炎癥反應、細胞增殖、血管生成、正調控磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導、血管內皮生長因子受體信號通路、MAPK激活、ERK1和ERK2級聯正調控等生物學過程來發揮抗腦缺血的作用；KEGG富集分析結果表明，腦泰方發揮抗腦缺血作用可能與MAPK、Neurotrophin、VEGF、PI3K-Akt、癌癥、cAMP、Ras等信號通路相關。

2.4 腦泰方對腦缺血大鼠神經功能評分的影響 腦缺血第7、15天，腦泰方組大鼠神經功能評分低于模型組(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組大鼠神經功能評分

2.5 腦泰方對腦缺血大鼠海馬p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬p-ERK1/2、BDNF蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，

腦泰方干預后大鼠海馬p-ERK1/2、p-CREB、BDNF蛋白表達均升高(P<0.05，P<0.01)，見圖6。

3 討論

中藥網絡藥理學構建“藥物活性成分-靶點以及疾病-靶點”多層次網絡結構圖，體現了中醫的整體性和辯證論治原則[23-24]，目前被廣泛應用于探討中藥或中藥復方在治療復雜疾病的作用機制[25-27]。因此本研究擬基于網絡藥理學分析方法對腦泰方活性成分進行篩選，靶點預測和疾病相關性分析，構建了成分-靶點-疾病網絡和腦泰方-腦缺血相關性靶點的 PPI 網絡分析腦泰方治療腦缺血的作用機制，共獲得了39種活性成分的629個預測靶點，平均一種活性成分對應約46.6個靶點，這充分顯示了腦泰方的多靶點作用。通過腦缺血疾病靶點映射篩選出80個預測靶點與腦缺血相關，發現腦泰方的主要活性成分中槲皮苷、山柰酚、異鼠李素等擁有較多的預測靶點，這可能是腦泰方抗腦缺血的重要藥效成分。其中槲皮苷能提高免疫功能[28]，山柰酚和異鼠李素有神經保護作用[29-30]。為了更好地了解腦泰方治療腦缺血的生物學過程和可能的信號途徑，將獲得的腦泰方與腦缺血相關的基因進行GO分析和通路分析，結果顯示腦泰方治療腦缺血的作用途徑主要與衰老、凋亡過程、炎癥反應、細胞增殖、血管生成、正調控磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導、血管內皮生長因子受體信號通路、MAPK的激活和ERK1和ERK2級聯的正調控有關。PTGS2、PPARG、NOS2、VEGFA、TNF是參與較多生物學過程富集的關鍵基因。細胞內的生物學功能是由蛋白與蛋白之間的相互作用實現，這種相互作用包括蛋白之間的直接物理作用和間接的生物學功能相關性，因此PPI網絡中某一蛋白尤其是核心蛋白的異常會引起級聯反應，從而產生疾病。本研究構建了腦泰方與腦缺血相關的靶點PPI網絡，通過拓撲分析找出核心靶點，結果顯示，VEGFA、TNF、CREB1、IL6、CASP3、BDNF、MAPK1擁有最多的蛋白相互作用，可能是腦泰方主要通過調控炎癥、血管生成、G蛋白偶聯受體信號通路、類固醇代謝和腺苷酸環化酶活性、腦源性神經營養因子和重組人有絲分裂原激活蛋白激酶1的表達而發揮藥效作用。KEGG富集結果進一步發現MAPK signaling pathway，Neurotrophin signaling pathway等屬于前20條信號通路。

為了驗證網絡藥理學的預測結果，首先從行為學結果進行了探討，神經功能評分結果顯示給予腦泰方干預后，腦缺血大鼠在的神經功能評分降低(P<0.05)，這說明腦泰方能顯著改善腦缺血后大鼠的神經功能缺損體征，接著對其作用機制進行探討。作為MAPK家族中關鍵組成部分，細胞外信號調節激酶(ERK1/2)是一類絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶。ERK表達廣泛，涉及細胞內包括細胞存活、細胞周期進入、細胞增殖和分化等一系列生命活動過程的調節。正常情況下ERK在胞漿中表達，而激活后轉移至胞核，通過磷酸化(p-ERK1/2)可以調節核內轉錄調控因子CREB的表達而產生細胞效應。本實驗結果顯示，腦缺血增強了大鼠海馬部位ERK蛋白的磷酸化水平(P<0.05)，而給予腦泰方干預后p-ERK1/2的蛋白表達增加(P<0.05)，這提示腦缺血后本身的應激可能增強了上游ERK信號分子的表達，而通過腦泰方的治療可增加大鼠海馬部位的ERK1/2磷酸化水平。CREB 可在不同信號通路的激酶作用下實現ser133磷酸化而活化，在學習記憶過程中發揮重要作用，且受到理化因素刺激后發生磷酸化(p-CREB)而被激活，促進其下游效應蛋白腦源性神經營養因子(BDNF)的表達。BDNF作為神經營養因子，可改善神經再生的微環境。腦缺血后BDNF的表達上調能促進腦梗死周圍部位的神經再生[31]。p-CREB和BDNF在大腦皮層和海馬的過表達可發揮神經保護作用[32]。本實驗結果顯示，與腦缺血模型組比較，腦泰方組大鼠海馬的p-CREB和BDNF蛋白表達均升高，這說明腦泰方通過促進腦缺血大鼠海馬p-CREB和BDNF蛋白的表達而發揮神經保護作用。

綜上所述，本研究通過網路藥理學確定腦泰方的抗腦缺血的化學活性成分、作用靶點及信號通路，且基于行為學和蛋白免疫印跡技術初步驗證了腦泰方可通過MAPK/ERK信號通路發揮抗腦缺血的作用。