基于網絡藥理學、分子對接和細胞實驗探討枸杞子防治老年性癡呆的作用機制

曾永長， 梁少瑜*， 姜倩倩， 吳俊洪， 劉常青， 宋力飛， 吳正治*

(1.深圳大學第一附屬醫院轉化醫學院，廣東 深圳 518035；2.深圳市老年醫學研究所，廣東 深圳 518020；3.廣州澤力醫藥科技有限公司，廣東 廣州 510663)

老年性癡呆也叫阿爾茨海默病，是一種典型的慢性中樞神經系統退行性疾病，其發病機制復雜，病因不明，臨床一線用藥以乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑為主，兩者只能控制癥狀，不能終止病程發展，且具有嚴重的不良反應。以傳統中藥延緩輕度認知障礙向老年性癡呆的轉化、終止甚至逆轉老年性癡呆的發展進程的研究逐漸成為熱點。

中醫認為，老年性癡呆病位在腦，五臟虛損為本，尤以腎為要。腎虛精虧、髓海不足是癡呆的基本病機。肝腎同源，腎水不足則水不涵木，精血虧虛，肝腎俱損。枸杞子是衛生部批準的藥食同源中藥材之一，其味甘，性平，歸肝腎經，有滋肝補腎、益精明目之功。藥理研究顯示，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、神經保護、保肝、抗腫瘤等作用。枸杞子能逆轉Aβ神經毒性，減弱因同型半胱氨酸誘導的神經元細胞死亡，增加SOD活性，降低MDA水平，上調α7nAChR表達等發揮抗衰老、神經保護、抗阿爾茨海默病作用[1-3]，但其活性成分如何協同整合影響疾病網絡尚未清楚。本研究擬采用網絡藥理學與分子對接相結合的方法，系統研究枸杞子防治老年性癡呆“活性成分-靶點-通路”的復雜關系，為枸杞子防治老年性癡呆的臨床使用提供科學依據，為藥食同源中草藥大健康產品開發提供借鑒。

1 材料

1.1 試劑與藥物 枸杞子(批號20210219)購自廣州紫云軒藥業有限公司。PC-12高分化細胞(批號PD20180827)、胎牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；TRIzol購自廣州洪祥生物醫藥科技股份有限公司；RPMI 1640及引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 數據庫與軟件 中藥系統數據庫及分析平臺(TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)；中藥數據庫@ Taiwan(TCM@Taiwan，http://tcm.cmu.edu.tw/)；中藥整合數據庫(TCMID, http://www.megabionet.org/tcmid/)；PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；PubChem(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound/)；治療靶標數據庫(TTD，http://db.idrblab.net/ttd/)；String 11.0(https://string-db.org/)；DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)；Protein Data Bank(PDB，http://www.rcsb.org/)；SYBYL-X1.3；Cytoscape 3.8.2。

2 方法

2.1 化學成分數據庫構建 以枸杞子為關鍵詞，檢索TCMSP、TCM@Taiwan及TCMID數據庫，獲取其化學成分信息，遵循藥物活性成分篩選條件，優選口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性(drug-like，DL)≥0.18者。另外，通過文獻檢索補充不在上述篩選范圍內，但也具有明顯生理活性的成分。

2.2 候選靶點及抗老年性癡呆潛在靶點預測 通過TCMSP和PubChem檢索枸杞子候選活性成分的三維化學結構，保存為mol2格式，將其輸入PharmMapper執行反向對接，以fit score≥3.5為條件，優化候選活性靶點。采用TTD、TCMSP數據庫查找候選靶點對應的疾病，并將其分類“mild cognitive impairment，Alzheimer disease，dementia”的靶點作為枸杞子防治老年性癡呆的潛在靶點。

2.3 可視化網絡、蛋白相互作用網絡構建及相關靶點通路和生物信息學分析 分別將枸杞子“候選活性成分-候選靶點”，防治老年性癡呆的“潛在活性成分-潛在靶點-通路”關系導入Cytoscape，構建“候選成分-候選靶點(candidate compounds-candidate targets，cC-cT)”和“防治老年性癡呆潛在成分-潛在靶點-通路(potential compounds-potential targets-pathways，pC-pT-P)”可視化網絡。將枸杞子作用靶點導入String，設定“Homosapiens，high confidence 0.7”，獲取蛋白相互作用關系，將蛋白相互關系導入Cytoscape 繪制PPI網絡，并篩選關鍵蛋白靶點，將枸杞子防治老年性癡呆的潛在活性靶點導入DAVID，進行 GO(gene ontology)和 KEGG(Kyoto encyclopediaof genes and genomes)分析。

2.4 活性成分-靶點分子對接研究 基于Tripos力場對活性分子進行能量優化，獲得最低能量構象，建立枸杞子對接化合物庫。PDB數據庫下載HSD11B1、INSR、NR3C1、RARA、CASP3、MAPK14、GSK3B、NOS2晶體結構，在Dock Ligands中對蛋白晶體去水，加氫，能量優化，選擇晶體本身的Ligand模式產生活性口袋，保存為sfxc格式。采用Surflex-dock模塊對上述潛在活性成分和靶點進行分子對接及打分。

2.5 Aβ25-35誘導PC12細胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2、CASP3 mRNA表達檢測 采用回流提取法制備枸杞子水提物，減壓干燥成浸膏粉，得率約為56.87%，采用無菌水配制成10 g/L，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，臨用前用無菌PBS分別稀釋至5.0、1.0 mg/mL。采用RT-qPCR法，取對數生長期的PC12細胞，分為對照組、模型組及枸杞子水提物1.0、5.0 mg/mL組，調整細胞密度為1×105/mL，接種于6孔板中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度培養箱中孵育24 h，棄去原培養基，加入相應藥物溶液繼續培養12 h，再加入Aβ25-35溶液使體系中Aβ25-35終濃度為25 μmol/L，繼續培養24 h，各組細胞處理結束后PBS潤洗，TRIzol裂解液使細胞充分裂解提取RNA，并轉錄成cDNA，特定引物(序列見表1)對各目的基因反轉錄后進行PCR擴增，反應程序為95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 30 s，循環45次。以GAPDH為內參基因，2-△△CT法計算各基因mRNA相對表達量。

表1 引物序列

2.6 Aβ25-35誘導PC12細胞CASP3蛋白表達檢測 采用Western blot法，按“2.5”項下方法分組后作用于PC12細胞24 h，收集細胞，PBS潤洗3次，加入裂解液，冰上裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，BCA法測定蛋白濃度。取各組蛋白40 μg，SDS-PAGE電泳，經轉膜、封閉、洗膜后，加封閉液稀釋的兔抗鼠一抗CASP3(1∶1 000)，在4 ℃下過夜孵育，TBST洗膜3次，每次15 min，加封閉液稀釋的HRP標記二抗(1∶10 000)，室溫下靜置1 h，TBST洗膜3次，每次15 min，ECL顯影，X光膠片曝光，洗片。

3 結果

3.1 枸杞子活性成分及靶點篩選 共獲得枸杞子192種成分，滿足OB≥30%、DL≥0.18者共46種，主要包括甾體、萜類、黃酮、含氮類等。此外，spermidine(亞精胺，OB=45.41%，DL=0.02)、cystadane(甜菜堿，OB=40.92%，DL=0.01)、neoxanthin(新黃質，OB=28.92%，DL=0.5)、cryptoxanthin(隱黃質，OB=25.16%，DL=0.57)、zeaxanthin(玉米黃素，OB=21.17%，DL=0.54)、lutein(葉黃素，OB=15.74%，DL=0.54)、vitamin C(維生素C，OB=13.34%，DL=0.04)。盡管OB或DL值較低，但考慮它們在藥材中的含量及生理活性[4-7]，仍然保留其做進一步的靶點預測以確保實驗周全性和準確性，具體見表2。

表2 枸杞子53種候選成分

將上述成分的mol2格式輸入Pharmmapper，進行反向藥效團匹配，共預測269個高匹配度靶點，其中與老年性癡呆相關的潛在靶點共31個，包括HSD11B1(11-β-羥化內固醇脫氫酶1)、RARB(β維甲酸受體)、NR3C1(糖皮質激素受體)、RARA(α維甲酸受體)、CALM1(鈣調蛋白)、KIT(肥大/干細胞生長因子受體)、IGF1(胰島素樣生長因子)、F2(凝血酶原)、FGFR1(堿性成纖維細胞生長因子受體1)、MET(肝細胞生長因子受體)、MAPK10(絲裂原活化蛋白激酶10)、MAPK14(絲裂原活化蛋白激酶14)、CASP3(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3)、PDE4D (cAMP特異性3,5-環磷酸二酯酶4D)、KDR(血管內皮生長因子受體2)、INSR(胰島素受體)、F11(凝血因子XI)、PPARG(過氧化物酶體增殖物激活受體γ)、ESR2(β雌激素受體)、BACE1(β分泌酶)、HMOX1(血紅素加氧酶1)、GSK3B(糖原合成酶激酶-3β)、ESR1(雌激素受體)、F7(凝血因子Ⅶ)、PPARD(過氧化物酶體增殖物激活受體δ)、SOD2(超氧化物歧化酶)、PDE4B(cAMP特異性3,5-環磷酸二酯酶4B)、NOS2(一氧化氮合酶，誘導型)、RAC1(Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物)、MAOB(胺氧化酶B)、ACE(血管緊張素轉換酶)。

3.2 枸杞子cC-cT網絡構建、PPI網絡分析及GO、KEGG富集分析 將53種候選成分和269個候選靶點的相互作用關系導入Cytoscape進行網絡構建，得到“cC-cT”網絡(圖1A)，藍色圓圈代表候選成分，紅色菱形代表候選靶點，節點大小代表相應的度(Degree)，共322個節點和3 472條相互作用關系，平均相鄰節點數21.57，充分體現枸杞子多成分、多靶點調控疾病的網絡特征。“cC-cT”網絡中Degree(D)最高的10種候選成分包括M49(neoxanthin，新黃質，D=131)、M35(cryptoxanthin monoepoxide，隱黃素環氧化物，D=126)、M02(31-norcyclolaudenol，去甲環鴉片甾烯醇，D=110)、M36(δ-carotene δ-胡蘿卜素，D=97)、M33(β-carotene，β-胡蘿卜素，D=95)、M50(cryptoxanthin，隱黃素，D=95)、M51(zeaxanthin，玉米黃質，D=95)、M41(physalin A，酸漿苦味素，D=93)、M52(lutein，葉黃素，D=91)、M04(cycloeucalenol，環桉烯醇，D=81)，Degree最高的10個候選靶點分別為MAP2K1、HNMT、RXRB、FECH、FABP7、SULT2B1、HSD11B1、CRABP2、RARB、PCTP，靶點與疾病的對應關系見表3(前10)，提示枸杞子與腫瘤、炎癥、肝損傷、認知障礙、神經退行性疾病等密切相關。

表3 枸杞子10個關鍵候選靶點、拓撲參數及疾病對應關系

通過String構建枸杞子活性靶點相互作用網絡(圖1B)，共233個節點和918條相互關系。通過節點度≥15篩選枸杞子關鍵靶點，獲得包括SRC、PIK3R1、HRAS、EGFR、HSP90AA1、MAPK14、GRB2、IGF1、PRKACA、RAC1、RXRA等31個蛋白，主要參與細胞免疫反應、調節ER應激和自噬、調控細胞周期和信號轉導、反向調節抗病毒基因轉錄、調控樹突棘形成、突觸可塑性等生理過程。

以P<0.01為條件，枸杞子活性靶點GO富集分析共獲得269條GO條目，包含180個生物過程(biological process，BP)、26個細胞組成(cellular component，CC)、63個分子功能(molecular function，MF)，見圖1C(前10)，涉及類固醇激素介導信號通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄起始、肽基酪氨酸自磷酸化、蛋白質自磷酸化、凋亡過程負調控等生物學過程，發揮調節類固醇激素受體活性、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、ATP結合及酶結合等功能。以P<0.01為條件，枸杞子活性靶點KEGG通路富集分析共獲得60條信號通路，涉及各類癌癥、胰島素信號通路、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路等。

3.3 枸杞子防治老年性癡呆“pC-pT-P”網絡構建及通路分析 將枸杞子防治老年性癡呆的“潛在活性成分-靶點-通路”相互作用關系導入Cytoscape進行網絡構建，得 “pC-pT-P”網絡(圖2A)，共98個節點(50種活性成分、31個活性靶點、17條信號通路)和567條相互作用關系。通過Cytohubba設定Maximal Clique Centrality(MCC)為30，構建枸杞子防治老年性癡呆C-T關鍵子網絡(圖2B)及各關鍵節點得分圖(圖2C)，可知枸杞子防治老年性癡呆的關鍵活性成分包括M35-隱黃素環氧化物、M49-新黃質、M02-去甲環鴉片甾烯醇、M33-β-胡蘿卜素、M36-δ-胡蘿卜素、M50-隱黃素、M52-葉黃素、M14-鈍葉醇、M18-羊毛甾醇、M07-環阿屯醇、M51-玉米黃質、M09-花色素苷等，關鍵靶點包括HSD11B1、NR3C1、RARB、CALM1、RARA、KIT、IGF1、F2、FGFR1、MET、MAPK10、CASP3、MAPK14等。KEGG通路富集分析(前10，圖2D)顯示，枸杞子防治老年性癡呆31個潛在靶點主要涉及癌癥通路、Rap1信號通路、Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路、神經營養因子信號通路、多巴胺能突觸、HIF-1信號通路及炎癥通路等。

3.4 分子對接研究 將枸杞子潛在活性成分neoxanthin(新黃質)、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環氧化物)、δ-carotene(δ-胡蘿卜素)、isofucosterol(異巖藻甾苷)、β-carotene(β-胡蘿卜素)、cryptoxanthin(隱黃素)、zeaxanthin(玉米黃質)與老年性癡呆核心靶點HSD11B1-2ILT、INSR-5ELS、NR3C1-3BQD、RARA-3kmr、CASP3-1gfw、MAPK14-6sfo、GSK3B-6hk4及NOS2-4nos進行分子對接，結果見表4、圖3。其中，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環氧化物)、cryptoxanthin(隱黃素)對HSD11B1，cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環氧化物)、cryptoxanthin(隱黃素)、δ-carotene(δ-胡蘿卜素)對INSR，β-carotene(β-胡蘿卜素)、cyanin(花色素苷)、cryptoxanthin monoepoxide(隱黃素環氧化物)對CASP3，cyanin(花色素苷)對GSK3B，δ-carotene(δ-胡蘿卜素)對NOS2結合得分大于6.0且配體與受體對接時不適程度較小，結合良好。

表4 枸杞子防治老年性癡呆關鍵活性成分與靶點對接得分

3.5 枸杞子水提物對Aβ25-35誘導PC12細胞GSK3B、MAPK14、ESR1、NOS2及CASP3 mRNA表達的影響 所選引物特異性良好，見圖4A。與對照組比較，模型組GSK3B、MAPK14、NOS2及CASP3 mRNA表達升高(P<0.05)，ESR1 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物組可抑制GSK3B、NOS2、CASP3 mRNA表達(P<0.05)，上調ESR1 mRNA表達(P<0.05)，見圖4B。

3.6 枸杞子水提物對Aβ25-35誘導PC12細胞CASP3蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組CASP3蛋白表達升高(P<0.05)；與模型組比較，1.0、5.0 mg/mL枸杞子水提物組可抑制CASP3蛋白表達(P<0.05)，見圖5。

4 討論

老年性癡呆的發生是一個連續的病理過程，經歷輕度認知障礙前期、輕度認知障礙期以及癡呆期。現有關于老年性癡呆的研究多集中在癡呆期，但這一階段神經元已出現大量死亡，病理進程難以逆轉，針對此階段所開發的藥物效果并不理想。將基礎和臨床研究的窗口前移，采用藥食同源的中藥材進行早期干預，實現延緩或阻止老年性癡呆的發展進程意義重大。

枸杞子著稱補肝益腎的“卻老子”，其成分豐富，含多糖類、黃酮類、萜類、甾體化合物、生物堿等活性成分，使其具有豐富的營養和生物活性，如抗腫瘤、抗增殖、抗氧化、保護中樞神經、抗動脈硬化等作用。本研究發現，枸杞子中隱黃素、新黃質、β-胡蘿卜素、δ-胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質等為枸杞子防治老年性癡呆的主要活性成分。類胡蘿卜素作為生命所必須的脂溶性色素，其具有顯著的維生素A原活性、抗氧化、抗腫瘤、保肝、神經保護、提高免疫力和抗炎等作用。現代藥理研究表明，β-胡蘿卜素具有提高SOD和GSH-Px的酶活性[8]，促進PPARG表達的同時抑制CASP3、CASP9、COX2、NF-κB的表達[9-10]，發揮抗炎、抗氧化的作用。葉黃素作為人腦中含量最高的類胡蘿卜素，其通過上調PPARγ、RXRα、IGF1、Bcl-2、GSK-3β和p-Akt的表達發揮神經保護作用[11-13]。玉米黃質具有增強抗氧化酶SOD、GSH-Px酶活性的作用[14]，其通過增加Akt表達，降低GSK-3β、Bax和CASP3的水平，激活Akt信號通路抑制氧化應激[15]。枸杞子防治老年性癡呆的活性靶點主要包括11β-羥類固醇脫氫酶1(HSD11B1)、β維甲酸受體(RARB)、糖皮質激素受體(NR3C1)、α維甲酸受體(RARA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(CASP3)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、糖原合成酶激酶-3β(GSK3B)，雌激素受體(ESR1)、胰島素樣生長因子(IGF1)等。HSD11B1作為糖皮質激素的代謝酶，其通過氧化還原將體內無活性的皮質酮轉化為有活性的皮質醇，致使局部糖皮質激素水平過高進而損傷海馬，影響認知功能[16]。維甲酸類受體屬于類固醇和甲狀腺激素受體家族，包括RARs和RXRs。RARA和RARB作為轉錄調節因子，在杏仁核、前額葉皮層和大腦廣泛表達，其通過識別靶基因的RARE調控基因轉錄，參與維持上皮組織的再生，免疫系統的調節，影響突觸生長形成。RARB通過HIF1α信號傳導系統促進線粒體的增殖和生長錐移動的速度，通過增加細胞內cAMP水平促進神經突起生長[17]。RARA作為海馬組織優勢核受體，其通過促進胞漿中GluR1翻譯誘導海馬神經元樹突棘的形成[18]。胰島素樣生長因子IGF-1可通過激活PI3K/Akt信號通路和ERK通路，增加Bcl-2的表達，抑制CASP3的活性抑制神經細胞凋亡[19-20]；通過增強L型鈣通道電流，使轉錄因子C/EBP β水平下降，抑制NMDA受體調節的鈣內流，促進小腦顆粒神經元存活，發揮神經保護作用[21]。

綜上所述，本研究采用網絡藥理學和分子對接相結合的方法探討藥食同源枸杞子防治老年性癡呆的作用機制，構建了枸杞子50個活性成分作用于31個潛在靶點，通過Ras信號，PI3K-Akt信號，神經營養因子信號，多巴胺能神經突觸，HIF-1信號等通路調控老年性癡呆的疾病網絡。本研究系統揭示了藥食同源枸杞子防治老年性癡呆的“活性成分-靶點-通路”的復雜關系，為藥食同源中草藥枸杞子臨床使用提供了理論基礎和科學依據。