UPLC-Q-TOF-MS法分析貓爪草化學成分

黃華靖， 江潔怡， 肖觀林， 曾志浩， 楊敏娟， 畢曉黎*

(1.廣州中醫藥大學第五臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫藥工程技術研究院，廣東 廣州 510095；3.廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095)

貓爪草為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的干燥塊根，其味甘、辛，性溫，入肝、肺二經，具有化痰散結、解毒消腫的功效，用于治療瘰疬痰核、疔瘡腫毒、蛇蟲咬傷，1977年開始收載于《中國藥典》[1-2]，具有抗結核[3]、抗腫瘤[4]、抗炎[5]、抑菌、免疫調節、抗氧化等作用[6]，臨床上常與其他藥物聯合治療肺結核、淋巴結結核、肺癌、淋巴癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、宮頸癌[6-10]、慢性乙型肝炎、甲狀腺炎等[11-12]，化學成分有酯類、有機酸、黃酮、苷類、生物堿、揮發油、多糖、微量元素、氨基酸等[1]。目前，貓爪草活性物質尚未明確，質量標準報道也較少。

近年來，UPLC-Q-TOF-MS法在中藥及其復方成分的定性鑒別中應用廣泛，具有高分辨率、高選擇性、高靈敏度等特點[13-14]。因此，本實驗采用該方法對貓爪草化學成分進行快速分析，以期為進一步闡釋其藥效物質、作用機制、質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器 ExionLC AC型液相色譜儀、X500R QTOF型質譜儀(美國Sciex公司)；KQ-700DE型數控超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Sorvall Legend Micro17R型微量離心機(美國Thermo Scientific公司)；XS205型電子分析天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 沒食子酸(110831-201204，純度89.9%)、蘆丁(100080-201409，純度91.9%)、小檗堿(110713-201814)、原兒茶醛(110810-201007)對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；原兒茶酸(Y-031-161227)、鞣花酸(R-004-170426)、咖啡酸(K-003-150730)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；對羥基苯甲醛(PS010495)對照品購自成都普思生物科技有限公司；亞油酸(AF7060202)對照品購自成都埃法生物科技有限公司，純度均大于98.0%。貓爪草于2019年8月購自河南省駐馬店市，經廣東省中醫藥工程技術研究院劉法錦研究員鑒定為毛茛科植物小毛茛RanunculusternatusThunb.的塊根。甲醇、乙腈、甲酸為色譜純(美國Fisher公司)；水為蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

2 方法

2.1 供試品溶液制備 取貓爪草5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，加熱回流2 h，放冷，用95%乙醇補足減失的質量，濾過，濾液減壓濃縮，甲醇定容至5 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、蘆丁、原兒茶醛、小檗堿、原兒茶酸、鞣花酸、咖啡酸、對羥基苯甲醛對照品適量，甲醇制成質量濃度為50 μg/mL，即得。

2.3 色譜條件 Waters CORTECS UPLC T3色譜柱(2.1 mm×150 mm，1.6 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%甲酸(B)，梯度洗脫(0～2 min，5%～15%A；2～8 min，15%～43%A；8～20 min，43%～65%A；20～37 min，65%～92%A；37～42 min，92%～98%A；42～45 min，98%A)；體積流量0.25 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量1 μL。

2.4 質譜條件 正負離子模式，掃描范圍m/z100～1 000；霧化氣、輔助氣壓力379.2 kPa；氣簾氣壓力241.3 kPa；霧化溫度500 ℃；毛細管電壓5 500 V/-4 500 V；裂解電壓100 V/-80 V；碰撞能量35 V。

2.5 數據庫建立 通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)、SciFinder、PubMed、ChemSpider等平臺，查閱相關文獻，收集貓爪草中196個化合物、毛茛屬植物報道的66個化合物，建立包括化合物名稱(含英文名稱)、分子式、相對分子質量、CAS號、分類的化學成分數據庫。

3 結果

3.1 成分鑒定 基峰離子色譜圖見圖1，共鑒別出37個化合物，包括20個有機酸，4個生物堿，3個酯類，2個香豆素，2個萜類，2個黃酮等，其中鞣花酸、小檗堿為首次從貓爪草中發現。通過查閱文獻[13-33]和比對對照品，結合裂解規律、保留時間、精確相對分子質量，對化學成分進行結構鑒定，結果見表1。

3.2 有機酸 包括化合物2～4、9、11～12、14、18、20、23～24、28～35、37。化合物2在負離子模式下的準分子離子峰為m/z169.013 7[M-H]-，脫去一分子COOH形成碎片離子m/z125.023 0，鑒定為沒食子酸[13]。化合物14在負離子模式下的準分子離子峰為m/z300.998 8[M-H]-，脫去一分子CO2、一分子CO后得到m/z257.009 6、229.014 5，脫去兩分子CO2、一分子CO后得到m/z185.024 6，鑒定為鞣花酸[33]。

3.3 香豆素 包括化合物5、8。化合物5在正離子模式下的準分子離子峰為m/z163.039 0[M+H]+，脫去一分子CO、一分子H2O形成特征碎片m/z135.043 9、117.033 7、117.033 7，再脫去一分子CO，形成特征碎片m/z89.038 6；m/z92.025 4由準分子離子峰脫去兩分子CO后再脫去一分子甲基形成，鑒定為傘形花內酯[18]。化合物8在負離子模式下的準分子離子峰為m/z177.019 5[M-H]-，二級質譜有m/z149.024 9、133.029 3、105.044 3的碎片離子，鑒定為秦皮乙素[19-20]，其裂解途徑見圖2。

表1 貓爪草化學成分

3.4 生物堿 包括化合物15～17、22。原阿片堿為普羅托品類生物堿，母核大多數為含有羰基的十元環，丟失羰基和1個氫可形成2個六元環，同時容易發生Retro-Diels-Alder(RDA)反應和α裂解，再繼續脫去羥基或水分子等取代基，其準分子離子峰為m/z354.133 8[M+H]+, 發生RDA裂解產生碎片m/z206.080 9、149.060 1，其中前者再發生RDA裂解，脫去1個OH產生碎片m/z189.078 5，鑒定為原阿片堿[30]，小檗堿為原小檗堿類生物堿，母核一般不發生裂解，裂解途徑以小分子取代基的裂解為主，如m/z321.099 2、292.096 4、278.081 2為取代基裂解形成的特征碎片離子峰。化合物22準分子離子峰為m/z336.122 7 [M+H]+，脫去一分子CH3可產生碎片m/z321.099 2或m/z320.105 1，后者再脫去一分子CO產生m/z292.096 4碎片；脫去兩分子CH3后，再脫去一分子 CO,可產生碎片m/z278.081 2，鑒定為小檗堿[31]，其裂解途徑見圖3。

3.5 萜類 包括化合物27、36。化合物27在負離子模式下的準分子離子峰為m/z487.339 4[M-H]-，脫去一分子 H2O，生成碎片m/z469.333 7，再脫去一分子HCOOH產生碎片m/z423.329 7，鑒定為積雪草酸[14,26]，其裂解途徑見圖4。

3.6 黃酮 黃酮苷元在質譜條件下裂解方式主要有CO、CO2、C2H2O、H2O等中性粒子的丟失，以及C環發生RDA裂解；黃酮苷則常發生糖基均裂，形成黃酮苷元離子[26]。化合物26在負離子模式下的準分子離子峰為m/z313.071 6[M-H]-，母離子丟失酰基得到碎片m/z271.061 5，再脫去一分子H2O得到碎片m/z253.050 5，鑒定為pinobanksin-3-O-acetate[25]。化合物13在負離子模式下的準分子離子峰為m/z609.147 0[M-H]-，脫去蕓香糖基產生離子m/z301.035 7，鑒定為蘆丁[32]。

4 討論

4.1 分析條件優化 本實驗考察不同提取溶劑、不同處理方式、不同提取時間，發現提取溶劑為95%乙醇、回流提取、提取時間為120 min時各分析物提取效果最好，響應值較高，故最終確定以95%乙醇加熱回流120 min作為供試品制備方法。在優化色譜條件時，考察乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸，結果表明，流動相為乙腈-0.1%甲酸時分離度好，色譜峰峰形較好，故以乙腈-0.1%甲酸為流動相。

4.2 化學成分分析 貓爪草具有抗結核、抗腫瘤、抗炎、免疫調節等作用[1]，其有機酸部位是發揮抗結核、抗腫瘤作用的活性成分之一[6]。采用 UPLC-Q-TOF-MS 技術檢測貓爪草中的化學成分，共鑒定37個化合物，包括20個有機酸，4個生物堿，2個香豆素，2個黃酮，2個萜類，大部分為有機酸類，部分具有明確生理活性。例如，咖啡酸具有抗氧化、抗炎、抗癌、調節DNA甲基化水平、升高白細胞與血小板[34]等作用；鞣花酸具有良好的抗腫瘤、抗氧化、保護肝損傷、抗菌、抗病毒、抗過敏、鎮靜降壓等作用[35]；沒食子酸具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤作用，在心血管系統疾病、神經系統疾病、糖尿病、肝纖維化等方面均有一定藥理作用[36]。但目前貓爪草有機酸部位發揮抗結核、抗腫瘤作用的活性成分尚未明確，有待進一步研究。

5 結論

本研究建立UPLC-Q-TOF-MS法快速分析貓爪草中化學成分，為進一步深入研究該植物有機酸部位、尋找其藥效物質、闡明作用機制提供依據，也為其質量標準建立提供參考。