肺癌患者血漿外泌體microRNAs標(biāo)志物的篩選

劉 霞，高孜博，丁麗華，吳擁軍

(鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001)

隨著對外泌體生物學(xué)的深入理解，外泌體的臨床應(yīng)用成為目前的研究熱點。外泌體是30～150 nm的細(xì)胞外囊泡，廣泛存在于各種體液中，并攜帶脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、mRNA和微小RNA(microRNA，miRNA)等生物分子[1]。外泌體不僅可以通過靶向遞送生物活性物質(zhì)參與許多生理病理過程進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞間通信，也是腫瘤微環(huán)境重要的組成部分[2]。外泌體的內(nèi)容物不是細(xì)胞質(zhì)單純的復(fù)制，而是由特定的蛋白質(zhì)和核酸被選擇性地分選到外泌體中[3]。越來越多的研究表明，外泌體中的生物活性物質(zhì)反映其細(xì)胞起源和疾病狀態(tài)，因此外泌體是疾病診斷和預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)志物[4]。近年來，在研究癌癥發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子途徑方面，miRNA引起了廣泛關(guān)注。除了細(xì)胞功能外，外泌體miRNA可能是癌癥篩查或輔助診斷的潛在生物標(biāo)志物[5]。最近，人們嘗試?yán)醚獫{外泌體miRNA作為癌癥篩查和輔助診斷生物標(biāo)志物，但至今尚未發(fā)現(xiàn)可用于肺癌篩查的miRNA生物標(biāo)記物。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究納入肺癌患者男性、女性各3例，平均年齡(65.2±9.3)歲，其中腺癌3例、鱗癌2例、小細(xì)胞癌1例。健康對照組男性、女性各2例，平均年齡(66.3±10.0)歲。入選的受試者基本臨床信息見表1所示。病例組來源于2018年12月—2019年12月某三甲醫(yī)院的住院患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)被證實為原發(fā)性肺癌；②入組前未接受放化療、藥物治療或手術(shù)治療；③無主要臟器功能衰竭；④未合并其他惡性腫瘤；⑤未處于妊娠或哺乳期。對照組全血樣本來源于2019年6—9月該院體檢中心的正常健康者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無肝炎、梅毒、HIV等傳染病病史、性疾病史和惡性腫瘤史；②無糖尿病、高血壓、心腦血管疾病及免疫系統(tǒng)疾病史；③與實驗組年齡和性別相匹配；④無主要臟器功能衰竭；⑤未合并其他肺部及呼吸系統(tǒng)疾病；⑥未處于妊娠或哺乳期。

表1 肺癌患者和健康對照者的臨床特征

1.2 主要實驗試劑與儀器

兔抗人CD63抗體購于Abcam 公司；鼠抗人HSP70抗體、鼠抗人TSG101抗體、兔抗鼠IgG-HRP抗體購于成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司；羊抗兔IgG-HRP抗體購于北京愛必信生物技術(shù)有限公司。

Agilent 2100生物分析儀，購于美國安捷倫科技有限公司；透射電子顯微鏡購于日本Hitachi公司；納米顆粒跟蹤分析儀購于英國馬爾文帕納科有限公司；超速離心機(jī)購于貝克曼庫爾特公司。

1.3 樣本采集與處理

本研究取得鄭州大學(xué)生命科學(xué)倫理審查委員會的批準(zhǔn)(ZZURIB 2021-106)，研究對象均已簽署知情同意書。每位患者采集3 mL全血樣本于EDTA抗凝管中，在4℃下4 000 r/min離心后收集1.5 mL血漿，置于凍存管中于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肺癌患者和健康對照者血漿外泌體的分離與鑒定

1.4.1 外泌體分離采用超速離心法提取血漿外泌體，首先37℃水浴溶解樣本，隨后4℃條件下先后經(jīng)過2 000 g、30 min，10 000 g、45 min離心后收集上清液；然后用0.22μm濾膜過濾，經(jīng)100 000 g離心70 min，用PBS重懸，再次100 000 g離心70 min，用預(yù)冷的PBS重懸外泌體沉淀，凍存于-80℃冰箱中。

1.4.2 外泌體鑒定取10μL外泌體溶液滴在銅網(wǎng)上，室溫下靜置自然風(fēng)干。用2%磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，多余染液用濾紙吸干，室溫晾干。使用透射電子顯微鏡在120 kV工作電壓下觀察外泌體形態(tài)。

將提取的外泌體原液按30～100倍稀釋，將稀釋液加入1 mL注射器內(nèi)，再將其加入檢測槽中，利用納米顆粒跟蹤分析儀檢測外泌體粒徑分布和濃度。

使用Western blot實驗BCA法檢測蛋白濃度，按常規(guī)方法進(jìn)行PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后分別加入稀釋后的CD63、HSP70、TSG101一抗孵育過夜，洗滌3次后再孵育二抗，膜上滴加ECL發(fā)光液后上機(jī)曝光，獲得條帶并保存。

1.5 肺癌患者和健康對照者血漿外泌體miRNA提取及質(zhì)量檢驗

在外泌體中加入1～2 mL TRIzol，反復(fù)吹打使外泌體充分裂解；加入200 mL氯仿，劇烈震蕩后4℃、13 000 r/min離心15 min；在最上層水相RNA溶液中加入等體積異丙醇，混勻靜置，再次離心；75%的乙醇溶液洗滌RNA，然后4℃、13 000 r/min離心5 min，棄上清，干燥；沉淀溶解于無RNA酶水，重懸沉淀，即可得到RNA溶液。用Agilent Bioanalyzer 2100對總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，使用瓊脂凝膠電泳法考察樣品總RNA的完整性。

1.6 血漿外泌體miRNA高通量測序及數(shù)據(jù)分析

每個樣本使用1μg RNA，用于建立血漿外泌體miRNA庫，經(jīng)過3′端接頭，5′端接頭，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增后，使用膠分離技術(shù)收集建立Small RNA(sRNA)文庫，使用Agilent Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)檢，根據(jù)結(jié)果確認(rèn)文庫的長度及質(zhì)量。經(jīng)Cutadapt(1.14版)、FASTX_Toolkit(0.0.13版)、NGS QC Toolkit(2.3.3版)軟件計算處理后得到高質(zhì)量clean reads用于后續(xù)分析。對篩選后的sRNA進(jìn)行長度分布統(tǒng)計。將篩選后的clean reads比對到人類參考基因組序列，統(tǒng)計能比對到基因組上的reads百分比。使用Bowtie(1.1.1版)軟件，對clean reads同Rfam(10.0版)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，提取R≤0.01的結(jié)果，注釋出rRNA、snRNA、snoRNA、tRNA等序列。將這些注釋到Rfam數(shù)據(jù)庫的序列進(jìn)行過濾去除，并去除能比對上轉(zhuǎn)錄本的序列且長度在15～41 bp范圍之外的reads。根據(jù)鑒定的已知的成熟體miRNA以及新預(yù)測的miRNA的序列，采用高通量測序技術(shù)進(jìn)行表達(dá)量統(tǒng)計，miRNA表達(dá)量計算采用TPM(transcript per million)計算外泌體miRNA表達(dá)量。采用R包中的DEG差異算法計算P值，篩選出P＜0.05、 |log2( FC) |≥1(FC：差 異 倍 數(shù))的miRNA。用TargetScan、PITA、miRNAorg 3個數(shù)據(jù)庫，采用Miranda軟件(3.3a版)進(jìn)行靶基因預(yù)測。靶基因的KEGG和GO分析采用R軟件的超幾何分布檢驗，并對P值經(jīng)Benjamini&Hochberg多重檢驗糾正后得到誤報率(false discovery rates，F(xiàn)DR)。

2 結(jié)果

2.1 肺癌患者和健康對照者血漿外泌體表征分析

根據(jù)國際胞外囊泡協(xié)會標(biāo)準(zhǔn)對分離的外泌體進(jìn)行表征。Western blot檢測結(jié)果見圖1，外泌體膜蛋白CD63和TSG101對應(yīng)的相對分子質(zhì)量分別在約30 ku和48 ku處，以及外泌體內(nèi)蛋白HSP70對應(yīng)的相對分子質(zhì)量約70 ku處均可見相應(yīng)的蛋白條帶。電鏡結(jié)果見圖2，可觀察到形態(tài)完整、大小均一的橢球形杯盤狀囊泡，直徑在100 nm左右。納米顆粒跟蹤分析結(jié)果見圖3，健康對照者血漿外泌體平均直徑為80.49 nm，顆粒濃度為3.49×109個/mL，肺癌患者血漿外泌體平均直徑為75.20 nm，顆粒濃度為3.84×109個/mL。由此可見，所分離的外泌體符合要求，可進(jìn)行后續(xù)的質(zhì)量檢驗和高通量測序。

圖1 外泌體標(biāo)志蛋白表達(dá)

圖2 電鏡下外泌體形態(tài)及大小

圖3 血漿外泌體的粒徑檢測結(jié)果

2.2 肺癌患者和健康對照者血漿外泌體miRNA的質(zhì)量檢驗

由于外泌體樣本的特殊性，RNA含量低，本研究提取了10例血漿樣本的總RNA，選用Agilent Bioanalyzer 2100對總RNA濃度進(jìn)行檢測，并表征電泳結(jié)果，評價RNA質(zhì)量。檢測結(jié)果見表2和圖4，該實驗成功對10例血漿外泌體樣本提取了總RNA，由結(jié)果可知肺癌患者血漿外泌體提取的總RNA含量整體高于健康對照者。

圖4 Agilent Bioanalyzer 2100檢測峰圖與電泳結(jié)果

表2 血漿外泌體RNA的提取結(jié)果

2.3 血漿外泌體miRNA高通量測序數(shù)據(jù)分析

通過高通量測序直接獲得原始數(shù)據(jù)的序列條數(shù)reads。肺癌組和健康對照組的最終reads數(shù)據(jù)量分別為19 978 985和17 216 884。外泌體sRNA進(jìn)行長度分析見圖5，篩選后的sRNA長度集中在20～23 nt，且在22 nt處出現(xiàn)峰值，檢測結(jié)果表明篩選后的sRNA與miRNA長度分布特征吻合。將篩選后的sRNA定位到人類參考基因序列上，結(jié)果顯示肺癌組和健康對照組中分別有12 116 998條和11 886 537條reads能比對到參考基因組序列上。

圖5 sRNA長度分布圖

2.4 生物信息學(xué)分析

2.4.1 肺癌患者與健康對照者差異miRNAs表達(dá)分析火山圖和差異表達(dá)統(tǒng)計柱狀圖見圖6，兩組間有142個表達(dá)差異miRNAs符合篩選標(biāo)準(zhǔn)，其中肺癌中有62個miRNAs表達(dá)上調(diào)，80個miRNAs表達(dá)下調(diào)。前20個上調(diào)和下調(diào)miRNAs的log2(FC)和檢驗P值見表3，表明這些miRNAs可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的調(diào)控作用。

圖6 肺癌患者與健康對照者差異miRNA篩選

表3 肺癌患者和健康對照者差異表達(dá)miRNAs列表(前20)

2.4.2 差異miRNAs靶基因GO及KEGG富集分析GO分析對差異miRNAs靶基因進(jìn)行功能分類注釋，主要包括生物學(xué)過程、細(xì)胞成分、分子功能3個方面。結(jié)果見圖7，肺癌患者和健康對照者差異表達(dá)的miRNAs靶基因主要參與了以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)信息傳遞、多細(xì)胞生物發(fā)育等生物學(xué)過程；存在于細(xì)胞核、胞漿、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外外泌體和線粒體等細(xì)胞成分中；參與到金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合、核酸結(jié)合、蛋白結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白同源二聚化活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能中。

圖7 肺癌組與健康對照組差異miRNAs靶基因GO富集分析柱狀圖

選擇KEGG通路分析中富集的前20條繪制氣泡圖，見圖8。差異基因主要富集在腫瘤、內(nèi)分泌等相關(guān)信號通路，包括肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、鈣信號通路、軸突導(dǎo)向信號通路、醛固酮的合成與分泌、胰島素分泌、黏著斑激酶、人類乳頭瘤病毒感染、小細(xì)胞肺癌、癌癥蛋白聚糖、ErbB信號通路、cAMP信號通路、Rap1信號通路等。

圖8 肺癌組與健康對照組差異miRNAs靶基因KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

最初的研究認(rèn)為外泌體是細(xì)胞的垃圾箱[6]，現(xiàn)已證實其在細(xì)胞間的交流中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。在這些過程中，外泌體可以調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的特性，以此抑制或促進(jìn)癌癥進(jìn)展[7]。且已有研究表明，消除外泌體可抑制腫瘤的進(jìn)展[8]。癌癥患者體液中不僅外泌體數(shù)量升高，其內(nèi)容物如miRNAs、蛋白質(zhì)等，也發(fā)生顯著改變[9]。因此，本研究通過對肺癌患者和健康對照者的血漿外泌體miRNAs進(jìn)行高通量測序，篩選差異表達(dá)外泌體miRNAs，期望篩選出可用于輔助肺癌篩查的腫瘤標(biāo)志物，為肺癌患者的篩查與監(jiān)測提供新靶標(biāo)與新方向[10]。

本研究選用6例肺癌樣本，包括3例腺癌、2例鱗癌和1例小細(xì)胞肺癌樣本，4例健康對照樣本。對外泌體miRNAs進(jìn)行了篩選，結(jié)果顯示142個miRNAs的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，其中肺癌患者中62個miRNAs表達(dá)上調(diào)，80個miRNAs表達(dá)下調(diào)。課題組前期對文獻(xiàn)中篩出的差異表達(dá)miRNA進(jìn)行驗證，提出10個血漿miRNAs(miR-21-5p、miR-20a-5p、miR-210-3p、miR-145-5p、miR-126-5p、miR-223-3p、miR-197-3p、miR-30a-5p、miR-30d-5p、miR-25-3p)可作為肺癌標(biāo)志物[11]，本研究的肺癌患者血漿外泌體中miRNA-126-5p、miRNA-197-3p同樣表達(dá)上調(diào)。所篩選出差異表達(dá)的多個外泌體miRNAs，在現(xiàn)有研究中有些被證實具有一定的肺癌篩查與診斷價值。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)膽管癌組織中miR-206表達(dá)下調(diào)，并證明miR-206是肝內(nèi)膽管癌的抑制劑。Zottel等[13]發(fā)現(xiàn)在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和星形膠質(zhì)細(xì)胞中miR-1-3p與腎細(xì)胞癌和甲狀腺癌有關(guān)，但在其相應(yīng)的細(xì)胞外囊泡中卻無明顯差異。Wang等[14]對大鼠血漿外泌體高通量RNA測序篩出的miR-29b-3p、miR-96-5p、novel 99-mature、novel 150-mature與本研究結(jié)果一致，但miR-142-3p、novel 39-mature結(jié)果卻相反，經(jīng)查閱文獻(xiàn)miR-142-3p在結(jié)直腸癌[15]、特發(fā)性肺纖維化[16]外泌體中高表達(dá)，可能與樣本不同有關(guān)，需進(jìn)一步驗證。miR-486-5p、miR-21-5p[17]也分別被證實在非小細(xì)胞肺癌患者、男性前列腺癌患者中表達(dá)失調(diào)，是潛在的腫瘤標(biāo)志物。同時，所篩選出的幾種差異外泌體miRNA在現(xiàn)有研究中表現(xiàn)出對肺癌轉(zhuǎn)移同樣具有的良好預(yù)判潛力。Zhang等[18]研究顯示miR-214在肺腺癌中高表達(dá)，這與本研究結(jié)果相一致。Wang等[19]研究中，miRNA-320a與其他兩種血漿外泌體miRNAs被成功用于識別轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。在非小細(xì)胞肺癌患者的臨床預(yù)后判斷模型中加入血漿外泌體miR-10b-5p水平的檢測，將顯著提高模型檢測效能[20]。

對篩選出的差異miRNAs進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)生物學(xué)過程類富集程度最高的前3種miRNAs類型為：以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄、以DNA為模板的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；細(xì)胞成分類富集程度最高的前3種miRNAs類型為：細(xì)胞核、胞漿、細(xì)胞質(zhì)；分子功能類富集程度最高的前3種miRNAs類型為：金屬離子結(jié)合、ATP結(jié)合、DNA結(jié)合。KEGG通路分析結(jié)果顯示差異基因主要富集在腫瘤和內(nèi)分泌等相關(guān)信號通路，其中，軸突導(dǎo)向信號通路、鈣信號通路、肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)、黏著斑激酶、癌癥蛋白聚糖、cAMP信號通路、人類乳頭瘤病毒感染、Rap1信號通路富集的差異基因數(shù)目最多。上述通路主要參與細(xì)胞增殖分化與凋亡、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移性擴(kuò)散、細(xì)胞遷移與黏附、炎癥反應(yīng)、趨化因子調(diào)節(jié)、細(xì)胞代謝與免疫反應(yīng)等功能。因此，本研究篩選出的肺癌患者血漿外泌體miRNAs有望成為肺癌篩查標(biāo)志物。

本研究通過對肺癌患者和健康對照者血漿外泌體miRNAs進(jìn)行高通量測序，篩選出有望成為肺癌篩查和輔助診斷的差異表達(dá)miRNA。但本研究對篩選的差異表達(dá)miRNA雖進(jìn)行生物信息學(xué)分析，但并未使用熒光定量PCR對差異miRNA進(jìn)行驗證。此外，所篩選出的多個差異miRNAs，部分已被證實對肺癌篩查與診斷具有一定的臨床應(yīng)用價值，但還有一些miRNA與文獻(xiàn)中相反，因此尚需后期擴(kuò)大臨床樣本量驗證這些差異miRNA，進(jìn)一步深度挖掘其在臨床中的應(yīng)用價值。