納米甲強龍脂質體對類風濕關節炎大鼠TNF-α、IL-1β和Ang-1的影響*

段衛峰，盧巖巖，張景偉

［河南省洛陽正骨醫院（河南省骨科醫院），河南 鄭州450000］

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis,RA）是一種常見的自身免疫性疾病，病理表現以關節滑膜組織及血管翳增生、骨質破壞為特征，臨床癥狀主要表現為四肢關節進展性、對稱性的關節炎。本病的主要病理表現為關節滑膜細胞的異常增生，滑膜血管翳形成并逐步侵蝕關節周圍結構，破壞關節軟骨及軟骨下骨，導致關節畸形并最終帶來關節功能的喪失，嚴重影響患者的生活質量［1］。類風濕關節炎的發病機制尚不明確，因此臨床上缺乏特異性的治療措施，主要以改善癥狀、延緩關節破壞為治療目標［2］。糖皮質激素具有強效抗炎和調節免疫效果，可快速控制RA 患者關節炎急性發作，對關節修復有一定的作用，但長期大量應用糖皮質激素會帶來嚴重的不良反應。隨著納米技術的發展，納米載藥系統為復雜的、難治性的自身免疫或炎癥性疾病的治療帶來一場新的技術革命，與傳統給藥方式相比，納米載藥具有靶向性、減少藥物用量、提高藥效、降低毒副反應等多種優勢［3］。本研究旨在探討納米甲強龍脂質體抑制類風濕關節炎大鼠模型滑膜細胞的增殖，探討其治療類風濕關節炎的機制，并為該方法治療類風濕關節炎提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗動物

48 只SPF 級雌性健康SD 大鼠，6～7 周齡，體質量（150±20）g，購自河南省動物實驗中心提供（許可證號：SYXK（豫）2015-0001），喂養于河南省洛陽正骨醫院實驗動物中心SPF 級實驗室，恒溫（23℃～25℃）恒濕（60%～65%）環境下喂養，自由飲用潔凈飲用水及標準飼料。

1.2 實驗藥品和試劑

甲強龍注射液（美國Prizer Manufacturing Belgium NV），甲強龍納米脂質體（上海舜納生物科技有限公司），免疫源性牛Ⅱ型膠原（美國Chondrex 公司，批號：150521），完全弗氏佐劑，血管生成素1（Ang-1）ELISA 試劑盒，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒，白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒。高速冷凍離心機，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模及分組 48 只健康SD 大鼠適應性喂養1 周后進行實驗，隨機選取10 只納入正常組，剩余大鼠納入造模組進行造模。造模方法選用Ⅱ型膠原誘導［4］，選取適量Ⅱ型牛膠原溶液（2 mg/mL）和同等比例的完全弗氏佐劑，在冰浴環境下，均質儀充分混合均勻，并乳化至油包水狀，最終制備成的乳劑中牛Ⅱ型膠原的濃度為1 mg/mL。于造模組每只大鼠尾根部皮下注射0.3 mL 該膠原乳劑，并在首次免疫后第7 天進行加強免疫，于造模組每只大鼠尾根部皮下注射0.2 mL 該免疫原。造模14 d 后，以造模組大鼠關節出現明顯發紅、腫脹、畸形等，即為造模成功。剔除造模未成功的模型，將造模成功的SD 大鼠采用完全隨機分組法將大鼠分為模型組、納米甲強龍（NMP）組、甲強龍（MP）組，每組10 只。

1.3.2 動物給藥 自免疫第1 天開始即給藥，NMP 組按照0.1 mg/kg 甲強龍納米脂質體尾靜脈注射，MP 組按1 mg/kg 甲強龍注射液尾靜脈注射，正常對照組與模型組注射2 mL 生理鹽水，均每天1 次，連續21 d。

1.4 觀測指標

1.4.1 體質量及臟器指數觀測 分別于給藥前和給藥第7、14、21 天使用電子秤測量大鼠體質量并記錄。藥物注射21 d 后處死動物，解剖分離處胸腺和脾臟并進行稱重。各組大鼠的胸腺指數、脾臟指數按照以下計算公式進行計算并記錄。

胸腺指數=大鼠胸腺質量（mg）/大鼠體質量（g）。

脾臟指數=大鼠脾臟質量（mg）/大鼠體質量（g）。

1.4.2 足跖腫脹度及關節炎AI 指數評分 分別于給藥前和給藥第7、14、21 天觀測大鼠四肢關節癥狀，如關節紅腫、畸形等表現，并拍照記錄。使用足跖容積儀測定足跖腫脹程度，按照以下公式進行計算：足跖腫脹度=（Vn-V0）/V0×100%，Vn=7、14、21 d 足跖容積，V0=0 d 即造模成功當天的足跖容積。

初次免疫兩周后，采用關節炎指數（arthritis index,AI）評估造模大鼠的關節紅腫程度、范圍以及關節腫大和變形情況，按0～4 級進行評分。0 分：關節無紅腫；1 分：小趾關節有紅色斑點且輕度腫脹；2 分：小趾關節及足跖關節有紅斑且腫脹；3 分：踝關節以下足跖關節腫脹；4 分：踝關節及全部足跖關節腫脹。分別于給藥前和給藥第7、14、21 天對造模大鼠進行關節炎AI 指數評分，并記錄。

1.4.3 標本采集 在大鼠造模成功后，各組大鼠目內眥取血大約2 mL。給藥第21 天，腹腔注射4%水合氯醛麻醉各組大鼠，腹主動脈取血約8 mL，血樣標本室溫下靜置1 h，2 500 r/min 離心機離心15 min，取上層血清，置于-80℃冰箱內保存。無菌條件下，取膝關節前正中切口，分離出膝關節滑膜層組織，部分組織置于脫鈣液中脫鈣，行HE染色。剩余部分置于-80℃冰箱內保存備用。

1.4.4 滑膜病理及免疫組化 取脫鈣處理后的膝關節滑膜組織，放置于4%多聚甲醛溶液內，室溫下固定24 h，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，切片，常規行滑膜組織HE 染色，在高倍顯微鏡下觀察各組大鼠滑膜微血管密度及滑膜組織病理變化情況。

1.4.5 血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量檢測 于造模前、造模成功后及用藥治療后，取適量大鼠血清，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟，測定各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β 和Ang-1 水平。

1.5 統計學方法

所有數據均采用SPSS 19.0 進行統計學處理。計量資料以均數±標準差（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 體質量比較

給藥前，各組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。給藥1 周、2 周、3 周后，各組大鼠體質量均較給藥前明顯增加，給藥2 周、3周后，模型組和給藥組體質量明顯低于正常組，甲強龍組和納米甲強龍組大鼠體質量均明顯高于模型組，差異有統計學意義（P<0.05）。而甲強龍組與納米甲強龍組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠體質量比較（n=10,,g）

表1 各組大鼠體質量比較（n=10,,g）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.2 胸腺指數、脾指數比較

與正常組比較，其余各組大鼠胸腺指數、脾指數均明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，甲強龍組和納米甲強龍組大鼠胸腺指數、脾指數明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）；但甲強龍組與納米甲強龍組之間比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組胸腺指數、脾指數比較（n=10,,mg/g）

表2 各組胸腺指數、脾指數比較（n=10,,mg/g）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.3 足趾腫脹度比較

與正常組比較，其余各組大鼠在初次免疫后1周、2 周、3 周足趾腫脹度明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，甲強龍組和納米甲強龍組大鼠2 周、3 周足趾腫脹度明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。甲強龍組與納米甲強龍組之間的比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠足趾腫脹度比較（n=10,,mL）

表3 各組大鼠足趾腫脹度比較（n=10,,mL）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.4 關節炎指數

與正常組比較，其余各組在給藥前、給藥1周、2 周、3 周大鼠關節炎指數明顯更高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，甲強龍組和納米甲強龍組大鼠在給藥1 周、2 周、3 周關節炎指數明顯更低，差異有統計學意義（P<0.05）。甲強龍組與納米甲強龍組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4。

表4 各組大鼠關節炎指數的比較（n=10,,分）

表4 各組大鼠關節炎指數的比較（n=10,,分）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

2.5 血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量比較

與正常組比較，其余各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型組比較，甲強龍組和納米甲強龍組大鼠關節炎血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05）。甲強龍組與納米甲強龍組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表5。

表5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量的比較（n=10,,pg/mL）

表5 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量的比較（n=10,,pg/mL）

注：1）與正常組比較，P<0.05；2）與模型組比較，P<0.05。

3 討論

在過去的20 年中，RA 的治療革命已經開始，在疾病早期通過規范化治療可取得良好的治療效果，在缺乏正規治療或失去最佳治療時機的情況下，疾病可發展為嚴重的關節畸形、功能喪失，甚至致殘。由于RA 的發病機制尚未完全明確，臨床治療上還缺乏特異性、針對性的方案。目前治療RA 的主要目標就是控制及延緩癥狀，預防關節破壞、關節功能的喪失。根據歐洲抗風濕病聯盟最新發布的指南，強調了疾病早期干預在類風濕關節炎治療中的重要性［5］。

糖皮質激素（GC）是目前作用最強的抗炎藥物，用于治療RA 至今已有60 余年歷史，具有強效的抗炎和調節免疫的功效，可快速控制RA 急性發作，改善RA 臨床癥狀，對關節修復有一定的作用，降低系統損害的風險，是治療RA 的一線藥物。糖皮質激素通常用于緩解急性疼痛，但隨著身體逐漸適應，此類藥物可能變得耐受或無效。同時，長期高劑量應用會增加骨質疏松、心臟病、糖尿病和肥胖的風險［6-7］。副作用的出現極大地限制了糖皮質激素藥物在RA 治療中的應用［8］，目前針對糖皮質激素副作用的方法通常包括藥物替代治療、改變劑量或對癥治療。近年來，具有主動/被動地靶向炎癥部位的納米制劑引起了大家的關注，納米制劑的表面積和納米尺寸的改變產生了有益的物理和化學性質，以獲得更好的藥理活性。納米材料藥物遞送系統克服了傳統藥物水溶性差、生物利用度低以及在體內非特異性分布的問題，從而提高藥物效率和治療活性［9-10］。納米材料藥物遞送系統可以通過靶向配體的表面修飾來實現主動靶向性，將藥物輸送到靶區，對病變部位產生特有的各種刺激，甚至可以添加造影劑來監測其生物分布、藥物累積或治療效果。

脂質體是一種新型有效的納米載藥傳遞系統，它是一種厚度為5～7 nm、直徑為25～500 nm 的人工膜，具有良好的生物相容性，可以提高藥物的靶向率，減少非特異性擴散，并易于對其進行合理修飾。ALDAYEL 等［11］采用酸敏感脂質體納米復合物，對TNF-α siRNA 的負載率超過90%，實時成像系統證實該藥物具有良好的靶向性和釋放特異性。SONG 等［12］報道了負載靶向巨噬細胞IL-1β 的siRNA 脂質聚合物雜化納米顆粒治療大鼠類風濕模型，結果表明，經尾靜脈注射后，FS14-NP/siRNA 將在巨噬細胞中迅速積聚，并降低巨噬細胞中炎性細胞因子的表達，顯著降低腳踝腫脹、骨侵蝕和軟骨破壞的程度。因此我們設計了負載甲強龍的脂質體納米載體，對Ⅱ型膠原蛋白誘導的CIA 大鼠模型進行靜脈注射，檢測模型大鼠血清TNF-α、IL-1β 和Ang-1 含量檢測，觀察該脂質體對RA 的治療作用。

多種炎癥細胞（如CD4 輔助性T 細胞、B 細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞和肥大細胞）的浸潤和激活，以及基質金屬蛋白酶和細胞因子（如腫瘤壞死因子TNF-α、IL1、IL6）的釋放，在RA 的發生中起主要作用［13］。TNF-α、IL-1β 具有較強的促炎活性，參與多種免疫應答，可誘導多種促炎介質，如細胞因子和趨化因子，通過NF-κB 通路激活內皮細胞，調節血管新生因子的繁殖，為各類炎性介質提供充足的氧，促使炎癥反應的快速進展［14］。IL-6 是一種多效性細胞因子，IL-6 表達升高導致多種自身免疫性和炎癥性疾病的發生，可刺激中性粒細胞遷移，促進破骨細胞和血管內皮生長因子（VEGF）生成，誘導炎性細胞浸潤，從而導致關節滑膜炎癥，進而形成關節破壞［15］。而TNF-α 和IL-6 受體阻斷劑，則可阻止相應通路，抑制炎癥因子釋放和破骨細胞生成，從而減緩RA的骨破壞［16］。本實驗結果表明，甲強龍和納米甲強龍脂質體均可顯著降低CIA 大鼠足跖腫脹度和踝關節AI 評分，降低血清中TNF-α、IL-1β 和Ang-1 水平，該作用的發揮可能是通過阻斷NF-κB通路，減少促炎因子釋放，抑制滑膜血管新生完成的，但納米甲強龍用量更少，且靶向性、安全性更高。

綜上所述，負載甲強龍的納米脂質體載藥系統可顯著減輕CIA 模型大鼠炎癥反應，緩解關節局部腫脹癥狀，其可能的作用機制與抑制滑膜組織中NF-κB 信號通路的激活有關。納米載藥系統可顯著減少藥物用量，減少毒副作用，同時還可負載靶向RNA 制備復合載體，更加準確的將藥物傳遞至病變部位，實現精準醫療，也為治療RA 提供了一個新的思路和方法。