乳品中常見過敏原特征多肽的篩查及制備應用*

雷 雯， 徐增益， 陳燕秋

(上海化工研究院有限公司/上海市穩(wěn)定同位素檢測及應用研發(fā)專業(yè)技術服務平臺 上海 200062)

乳和乳制品是人體重要的蛋白質來源，是營養(yǎng)健康的重要保證，其中乳蛋白是最有營養(yǎng)價值的部分，包括乳清等物質[1-4]。β-乳球蛋白是乳清中的主要蛋白質，基本存在于所有牛類的乳汁中，也是市售乳品中的一種物質，其在牛奶中含量較高，占奶類中所有蛋白質的7%～12%[5-7]。但β-乳球蛋白又是乳品中主要的過敏原，其次為α-乳球蛋白[8]。β-乳球蛋白在牛科動物中屬于免疫球蛋白，在大量動物體試驗中發(fā)現，β-乳球蛋白的水解物質或某些片段能夠起到降膽固醇和抗氧化的作用。不過，該物質對于嬰幼兒卻是“威脅”。經統(tǒng)計，β-乳球蛋白極易導致嬰幼兒出現過敏癥狀，因為嬰幼兒消化系統(tǒng)發(fā)育不完全，β-乳球蛋白一進入嬰幼兒體內就會被判定為病原，從而誘發(fā)免疫反應。此外，影響牛乳及乳蛋白的因素有很多，產地、土壤元素含量等都能對飼草造成影響，進而對牛乳及乳蛋白造成差異[9-10]，因此開展有關β-乳球蛋白檢測方法的研究是行業(yè)的迫切需要[11-14]，更是對嬰幼兒健康的保證。

目前，針對食品過敏還未研究出特效療法，乳品過敏患者只能謹慎防止攝入含有過敏原的食品。國外針對乳品過敏原β-乳球蛋白的準確定量已有了一定的研究[13,15-16]，但國內還鮮有報道。本文主要對過敏原β-乳球蛋白的特征肽段進行初步篩查，篩選出較為穩(wěn)定的IDALNENK作為特征多肽，并制備出內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)，可應用在市場上常見乳品中β-乳球蛋白的檢測。

1 試驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LCMS-2020型液相色譜質譜聯用儀，日本Shimadzu公司；Milli-Q型純水機，德國Merck公司；1 000 μL移液槍、XP205型分析天平，瑞士梅特勒公司；TGL-16aR型冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠；冰箱、熱鼓風恒溫儀，上海一恒科學儀器有限公司。

胰蛋白酶和β-乳球蛋白(質量分數≥90%)標準品，美國SIGMA公司；碳酸氫銨、碘乙酰胺、二硫蘇糖醇、甲酸(色譜級)、乙腈(色譜級)，國藥集團上海有限公司。

β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK和內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)均由上海化工研究院有限公司合成；純牛奶購自超市。

1.2 標準溶液配制

β-乳球蛋白特征多肽標準儲備溶液(1 mmol/L)：稱取β-乳球蛋白特征肽段IDALNENK固體適量，用50 mmol/L NH4HCO3溶液溶解。梯度稀釋配制成濃度為1、5、10、20、50、80、100 μmol/L的系列標準對照溶液。

精密稱取內標物IDAL*NENK適量，用水配制成2 mmol/L儲備溶液在-80 ℃凍存。臨用前配制成0.1 mmol/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品溶液的制備

精密量取牛奶1 mL，用50 mmol/L NH4HCO3稀釋至100 mL。取200 μL的樣品(稀釋后的乳制品、系列標準對照溶液)，加入0.1 mmol/L內標物溶液20 μL混勻。隨后加入50 mmol/L二硫蘇糖醇溶液200 μL，在熱鼓風恒溫儀中于70 ℃反應60 min，取出后冷卻至室溫，加入100 mmo/L碘乙酰胺溶液200 μL，置于暗處在30 ℃反應30 min。再加入1 g/L胰蛋白酶溶液200 μL，在37 ℃反應20 h，最后加入10%(體積分數，下同)甲酸溶液200 μL，室溫靜置60 min終止反應。離心取上清液凍干，加入0.1%甲酸溶液200 μL復溶，過0.22 μm濾膜后，移至液相瓶中待測。

1.4 內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的制備

采用固相合成法(見圖1)制備內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)，然后對其進行純化，計算并分析該內標物的同位素豐度、化學純度。

圖1 特征多肽的固相合成路線

1.5 色譜條件和質譜條件

色譜柱：Shimadzu C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相A：0.1%甲酸溶液。流動相B：0.1%甲酸-乙腈溶液。流量：1.0 mL/min。柱溫：35 ℃。進樣量：10 μL。梯度洗脫：初始B相為10%，保持3 min；在8.0 min內線性升至30%；然后0.5 min內B相線性升至90%，保持2.0 min；之后在0.5 min內，B相降至10%的初始梯度條件，平衡2.0 min后開始下一個進樣程序，總洗脫時間16 min。

電噴霧正離子模式：ESI+。質譜掃描方式：多反應監(jiān)測(MRM)掃描，特征多肽IDALNENK的質荷比(m/z)為459/803，內標物IDAL*NENK的m/z為462.5/810。毛細管電壓：3.5 kV。鞘氣流量：13 mL/min。離子傳輸管溫度：275 ℃。

2 結果與討論

2.1 特征多肽的篩查

通過蛋白質組學數據庫UniProt可獲得β-乳球蛋白(ID：P02754)的氨基酸序列，導入酶解模擬軟件Skyline模擬β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解。由于β-乳球蛋白受熱或者烘烤時易發(fā)生成環(huán)、交聯或者氧化等反應，選擇的特征多肽若不夠穩(wěn)定，將會影響定性和定量結果。隨著蛋白質組學的不斷發(fā)展，酶解成為該領域較為成熟的技術，酶解技術結合蛋白質組學數據庫及分析軟件在蛋白質組學中有著舉足輕重的地位。因此，在選取特征多肽時，存在漏切位點、有NXS/T的糖基化基序、易成環(huán)、易氧化、存在修飾的多肽一般不作為特征多肽的備選，從而確保特征多肽的穩(wěn)定性。經此特定條件篩選的4條多肽見表1。

表1 β-乳球蛋白篩選后的理論酶解多肽

2.2 特征多肽的選擇

為便于乳品定量檢測并降低檢測成本，確定1條穩(wěn)定性強和抗干擾性能優(yōu)越的多肽作為β-乳球蛋白的特征多肽，對表1篩選出的4條多肽進行了試驗探索。對同一個β-乳球蛋白標準品的酶解溶液(進完樣儲存于4 ℃的冰箱中)，每隔6 h進樣測定，試驗結果表明：LIVTQTMK、IDALNENK、VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK這4條多肽在0～24 h偏移較小(見圖2)；而在24～48 h，多肽LIVTQTMK含量明顯大幅下降，相比于其他3條多肽的穩(wěn)定性較差。

為考察4條多肽的抗干擾性能，取21份β-乳球蛋白的標準溶液分成7組，每組3份平行樣，分別酶解4、6、8、12、16、20、24 h，按照1.3對樣品酶解后進行檢測，結果見圖3。

由圖3可知：在酶解時間超過10 h后，多肽IDALNENK的含量已趨于穩(wěn)定；隨著酶解時間的延長，酶的自切產物不斷增多，導致VLVLDTDYK和TPEVDDEALEK在質譜中的響應不斷升高，表明酶的自切產物對這2條多肽有增益效果，呈現出增長趨勢；而對于LIVTQTMK來說，酶的自切產物對其具有抑制作用，導致其含量呈現降低趨勢。因此，多肽IDALNENK的抗干擾性能強于其他3條多肽。

結合多肽穩(wěn)定性和抗干擾性的比較，選擇穩(wěn)定性和抗干擾性都較為優(yōu)越的多肽IDALNENK作為特征肽段。

2.3 IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)同位素豐度及化學純度分析

化學純度和同位素豐度是衡量同位素內標的關鍵，一般化學純度≥98%(質量分數)、同位素豐度≥98%是優(yōu)異的同位素內標，可應用于復雜樣本的定量中。

2.3.1 同位素豐度分析

將合成的IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)稀釋后，進行同位素豐度6次平行測定，通過特征離子質量簇，計算得出IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的平均同位素豐度為99.2%，相對標準偏差(RSD)為0.11%，同位素豐度指標超過98%。

2.3.2 化學純度分析

內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)市面上并無標準品，合成過程中引入的雜質均為肽段，因此采用高效液相色譜法檢測后的面積歸一化來進行化學純度的衡量。內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的高效液相色譜圖見圖4。

圖4 內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)的高效液相色譜圖

由圖4可知，除了2號主峰外，還有2個小雜峰，具體占比見表2。

表2 IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)化學純度檢測的原始數據

純化后的內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)經面積歸一化所得純度為99.11%，純度較高。從儲備液中平行取出6份樣品進行化學純度檢測，平均化學純度達到98%以上，純度較高。

根據化學純度和同位素豐度的檢測結果可知，化學純度和同位素豐度指標均可滿足對內標物的要求。

2.4 應用

在市場上購買3種不同廠商生產的奶品，各取6份樣品，按1.3的方法進行處理，然后進樣分析，內標法計算結果，β-乳球蛋白的測定結果見表3。

表3 內標法測定3種奶品中β-乳球蛋白含量

通過建立的同位素稀釋質譜法測定3種奶品中β-乳球蛋白的含量，測定值的RSD<6%。不同廠家生產的乳品中β-乳球蛋白的含量差異不大。

3 結語

本文采用靶向蛋白質組學技術，結合具體試驗篩選出乳品主要過敏原β-乳球蛋白的特征多肽IDALNENK，該肽段穩(wěn)定性好，抗干擾性能強。對制備的內標物IDAL*NENK(13C6,15N-Leu)進行化學純度和同位素豐度的檢測，同位素豐度>98%，化學純度>98%，滿足同位素稀釋質譜法準確定量的要求。將該內標物應用于奶品中β-乳球蛋白的測定，靈敏度高，結果準確。