下調DJ-1基因對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖和侵襲影響的研究

萬顏凱，黃小華，麥秀章，曾憲明

1.東莞市企石醫院 病理科，廣東 東莞 523500；2.東莞市企石醫院 預檢分診，廣東 東莞 523500；3.東莞市企石醫院 客服中心，廣東 東莞 523500；4.東莞市企石醫院 外科，廣東 東莞 523500

0 引言

近些年來，甲狀腺乳頭狀癌的發病率呈現持續上升，雖然甲狀腺乳頭狀癌患者的預后大部分呈良好趨勢，死亡率較低，但臨床隨訪資料也發現，遠處轉移和復發屬于患者惡性進展的危險因素，一旦患者出現轉移或者復發的情況，其惡性程度明顯增高，患者死亡率也隨之上升[1-2]。因此，探尋有價值的甲狀腺乳頭狀癌的預后評估分子指標和分子治療靶點對早期預測患者預后和及時干預具有重要臨床價值。本研究采用siRNA技術下調人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株中DJ-1蛋白表達，進而觀察細胞的遷移和侵襲行為變化情況，初步分析DJ-1基因調控甲狀腺乳頭狀癌細胞發生遷移及侵襲行為的可能發生機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株，DJ-1 siRNA 正義鏈序列：正義鏈序列5′-GCUCUGU UGGCUCAUGAAATT-3′，由上海吉瑪公司合成，非特異隨機序列由上海吉瑪公司贈送，Scramble 正義鏈序列：5′-UUCUCC GAACGUG UCACGUTT-3′。RPMI-1640培養基和10%胎牛血清購自美國Hyclone公司，脂質體lipofectamine TM 2000購自美國Invitrogen公司。BCA法蛋白定量測定試劑盒海門碧云天生物技術公司。Transwell實驗所用的小室購自Corning。Matrigel matrix購自BD。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

RPMI-1640培養基（含10%胎牛血清）中對人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株進行培養，培養條件：37℃，5% CO2飽和濕度。

1.2.2 實驗分組和轉染

轉染分3個組：空白對照組：對人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞不做任何處理。轉染非特異性對照組：對細胞轉染Scramble RNA 20nmol/L，并加入適量Lipofect 2000TM；轉染si DJ-1組對細胞轉染DJ-1 siRNA 20nmol/L，并加入適量Lipofect 2000TM。各組實驗細胞均孵育20min（室溫條件），然后轉移至培養板中，24h后即可收集細胞。

1.2.3 Western印跡法（WB）

應用WB法檢測各組實驗細胞中DJ-1蛋白表達情況。收集各組細胞，加入細胞裂解液，讓細胞得到充分裂解后進行總蛋白提取，提取后進行BCA法蛋白定量測定蛋白含量，然后進行WB檢測。

1.2.4 細胞遷移和侵襲行為觀察實驗

（1）細胞遷移實驗操作過程：在遷移小室中加入各組細胞懸液，注意遷移小室濾膜是沒有細胞外基質膠，繼續培養24h后，將遷移小室拿出，倒棄內部的培養液，采用棉簽將表面沒有遷移的殘留細胞輕輕擦拭，并將小室濾膜下表面的細胞立即采用無水乙醇固定，然后加入結晶紫染色。對染色后的細胞進行顯微鏡下觀察，隨機五個視野（×100）觀察細胞并計數，計算平均值。

（2）細胞實驗操作過程：首先進行細胞外基質膠的配置，按照6.7%的比例，在Transwell小室內加入20μl含MatrigelTM的培養液，使Transwell小室濾膜表面形成一層細胞外基質膠。在Transwell小室中加入各組細胞懸液，繼續培養36h后，將Transwell小室拿出，倒棄內部的培養液，采用棉簽將表面未穿過聚碳酯膜小孔的殘留細胞及表面細胞外基質膠輕輕擦拭，立即采用無水乙醇固定穿過小孔細胞，然后加入結晶紫染色。顯微鏡下（×100）隨機五個視野觀察細胞并計數，取其平均值作圖分析結果。

1.3 統計學方法

應用SPSS 19.0版統計軟件進行數據分析。計量資料采用t檢驗，P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組DJ-1蛋白的表達水平比較

轉染si DJ-1組DJ-1蛋白的相對表達量明顯較空白對照組和轉染非特異性對照組減弱（P＜0.05），而后兩者之間比較，DJ-1蛋白相對表達量相似，差異無統計學意義（P＞0.05，圖1）。表明轉染si RNA后，人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株中DJ-1蛋白表達水平明顯受到了抑制。

2.2 DJ-1-siRNA對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株體外遷移力和侵襲力的影響

在細胞遷移和侵襲實驗中，轉染si DJ-1組中遷移穿膜和侵襲穿膜的細胞數量均明顯少于空白對照組和轉染非特異性對照組（t遷移=4.494，4.481，t侵襲=4.039，3.594，P＜0.05），而后兩者之間，差異無統計學意義（t=2.068，2.141，P＞0.05），見表1和圖2、圖3。說明沉默DJ-1表達后，甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞株的運動能力和侵襲能力明顯受到抑制。

表1 DJ-1-siRNA 對甲狀腺乳頭狀癌TPC-1 細胞株體外遷移力和侵襲力的影響

3 討論

盡管大部分甲狀腺乳頭狀癌的惡性潛能相對不高，病例的預后尚佳，患者10年生存率有95%以上，但臨床會遇到一些發生復發轉移的病例，其預后不佳，死亡率明顯增高[3]。目前，甲狀腺癌的分子生物靶向治療受到美國甲狀腺協會和美國國立綜合癌癥網絡的推薦，能讓患者獲得更有利的治療方案。因此，探明甲狀腺乳頭狀癌發生轉移和復發的具體調控機制，尋找有價值的甲狀腺乳頭狀癌的預后評估分子指標和分子治療靶點成為近年來的研究熱點[4-5]。

近年來，國內外較多文獻對DJ-1基因參與惡性腫瘤發生和惡性演進的作用機制進行了研究，結果發現DJ-1的細胞轉化、抗凋亡、抗氧化應激等調控功能在惡性腫瘤的發生發展過程中可能起重要作用[6-9]。目前，在甲狀腺癌中DJ-1 基因表達情況相關研究報道不多，且仍存在爭議，國內李海研究[10]檢測到 DJ-1在甲狀腺癌組織中出現高表達，推測其應與甲狀腺癌的發生密切相關，但沒有發現DJ-1高表達與甲狀腺癌預后有相關性；而國內酈秀芳[11]相關研究卻發現甲狀腺癌的發生、浸潤、淋巴結轉移等惡性臨床特征與DJ-1過表達密切相關。本研究前期結果顯示，甲狀腺乳頭狀癌組織中存在DJ-1特異性高表達，且伴有DJ-1高表達的病例出現更強的浸潤和轉移等惡性生物學行為。

在此研究基礎上，本研究設計了DJ-1基的siRNA序列，并轉染甲狀腺乳頭狀癌細胞株進一步沉默DJ-1表達，檢測結果發現經過si DJ-1轉染后，轉染組細胞中DJ-1蛋白受到明顯抑制，相對表達明顯較其他兩對照組減弱（P＜0.05），說明經過轉染si RNA后，沉默了甲狀腺乳頭狀癌細胞中DJ-1蛋白表達。進一步體外觀察si RNA DJ-1轉染對甲狀腺乳頭狀癌細胞發生遷移和侵襲行為的影響，結果顯示轉染組細胞發生遷移穿膜細胞數和侵襲穿膜細胞數均出現顯著減少，說明轉染siRNA后，沉默了DJ-1表達，抑制DJ-1表達后，隨之該基因涉及的一系列調控作用也被抑制，進而對甲狀腺乳頭狀癌細胞的遷移和侵襲行為起到了一定抑制作用，提示了DJ-1可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲轉移存在相關性，DJ-1高表達將調控甲狀腺乳頭狀癌細胞發生遷移、侵襲行為，通過以后更為深入的相關機制研究，了解DJ-1的分子調控機制，將有望為甲狀腺乳頭狀癌發生復發和轉移者的分子靶向治療提供新靶點和研究方向。