血清miRNA-21-5p、miRNA-122-5p表達水平對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性髖部骨折的診斷價值評價

李毛召，龍果，李文強

1.喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院，新疆 喀什 844000；2.巴楚縣人民醫(yī)院，新疆 喀什 843800

0 引言

骨質(zhì)疏松性髖部骨折是常見的疾病之一，而絕經(jīng)后的女性受到年齡的增長，更容易出現(xiàn)骨重建失衡，在患者絕經(jīng)后其雌激素水平相對更低，而雌激素對破骨細胞的抑制作用也就相對降低，因此導(dǎo)致破骨細胞數(shù)量增加及凋亡減少，從而影響患者的骨吸收功能。miRNA參與的表觀遺傳在骨代謝過程中發(fā)揮著重要作用，當miRNA含量出現(xiàn)變化時期調(diào)節(jié)的靶基因表達水平也可隨之改變，而在病理條件下，異常的miRNA信號網(wǎng)絡(luò)能夠作為骨質(zhì)疏松疾病的發(fā)生與進展診斷指標[1]。對此，本文將本院收治的骨質(zhì)疏松性髖部骨折患者血清miRNA-21-5p、miRNA-122-5p表達水平情況，旨在分析兩項指標的診斷價值，詳見下文所示。

1 資料和方法

1.1 一般資料

將我院2020年1～12月收治的髖部骨折患者作為研究的觀察對象，共有60例患者，分為四個組別，分別為正常組、骨質(zhì)減少、骨質(zhì)疏松癥、嚴重骨質(zhì)疏松癥組，每組15例，其中正常組年齡49～74歲，平均（61.25±2.54）歲；骨質(zhì)減少組患者年齡49～78歲，平均（61.23±2.56）歲；骨質(zhì)疏松癥患者年齡51～79歲，平均（61.27±2.52）歲；嚴重骨質(zhì)疏松組患者年齡52～76歲，平均（61.23±2.55）歲。四組患者的一般資料對比無差異（P＞0.05）。

納入標準：血常規(guī)、生化、骨骼轉(zhuǎn)化指標P1NP和S-CTX，骨密度及其他所有術(shù)前必要的檢查準確相關(guān)疾病者；所有納入本研究的患者均需要被詳細告知研究方案，充分理解并同意簽字；所有研究方案及過程需要經(jīng)過我院倫理委員會審批通過。

排除標準：年齡少于49歲；患有其他骨骼-肌肉代謝性疾病、糖尿病、其他種類的代謝性疾病；乙肝、丙肝、HIV以及因其他疾病原因服用糖皮質(zhì)類；本次入院前未進行正規(guī)抗骨質(zhì)疏松治療；未使用其他含有激素類影響人體代謝的藥物長達1個以上的患者或因基礎(chǔ)疾病無法耐受手術(shù)的患者。

1.2 方法

miRNA分析：RNA的提取，本實驗選用傳統(tǒng)Trizol法和專用于miRNA提取的miRNA試劑盒（Tiangen公司），并比較兩者提取效率差異。分別取300μL血清、2mg組織于無核糖核酸酶（Rnase）的EP管中，加入有1mL TRLZOL的離心管中，混勻。室溫放置5min以上，加入200 mL的氯仿，顛倒混勻后室溫放置2～5min。4℃，12000rpm離心15min，吸取上清于另一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃放置30min以上。4℃，12000rpm離心15min，倒掉上清液。加入75%的乙醇，使沉淀漂浮起來洗滌。4℃，12000rpm離心15min，倒掉上清液。用無RNA酶的水溶解沉淀，濃度測定與1.5%瓊脂糖凝膠電泳，125V、17min，電泳完畢后使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。剩余RNA置于-80℃保存。miRNA的逆轉(zhuǎn)錄：采用復(fù)能基因公式的cDNA合成試劑盒，該法在逆轉(zhuǎn)錄之前先多聚A加尾，多聚A加尾法逆轉(zhuǎn)錄后可供檢測多種miRNA。取上述miRNA溶液18μL按要求制成25μL反應(yīng)體系；于PCR儀器中37℃60min，后85℃+5min；cDNA溶液保存于-30℃，備用。miRNA的qPCR定量檢測：實時檢測miR-16和miR-21表達量采用復(fù)能基因公司的All-in-OneTMqPCRMix。上述cDNA溶液稀釋10倍后，取5.6μL稀釋液按說明書制成20μL的PCR反應(yīng)體系。于ABI7500實時PCR儀器上檢測SYBRGREEN反應(yīng)信號，擴增曲線后加入溶解曲線以確認擴增產(chǎn)物的特異性。所有的PCR反應(yīng)均行3副孔，循環(huán)閾值（Cq值）的原始數(shù)據(jù)隨后使用插入控制分析和缺失值的歸算來消除技術(shù)差異。

1.3 觀察指標

在患者納入后分析四組患者血清及股骨頭組織中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平變化，同時對比正常組與骨質(zhì)疏松性髖部骨折組的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p變化，并分析miRNA-21-5p、miRNA-122-5p對疾病的敏感度、特異度及準確性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0軟件計算，計數(shù)資料、計量資料表示為（%）（），分別采用卡方檢驗和t檢驗，如組間對比結(jié)果為P＜0.05，則表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 分析四組血清及股骨頭組織中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平變化

四組患者的血清及股骨頭組織中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平之間進行對比分析可見，血清與股骨頭之間的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平對比并無明顯差異（P＞0.05），詳見表1所示。

表1 四組患者血清及股骨頭組織中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 水平變化對比分析（）

表1 四組患者血清及股骨頭組織中的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 水平變化對比分析（）

注：*與血清檢查結(jié)果對比并無明顯差異（P＞0.05）。

2.2 分析正常組與骨質(zhì)疏松性髖部骨折組的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p變化

骨質(zhì)疏松性髖部骨折組患者的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平明顯更高于正常組患者，對比統(tǒng)計學(xué)差異明顯（P＜0.05），詳見表2所示。

表2 正常組與骨質(zhì)疏松性髖部骨折組兩組間的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 變化對比分析（）

表2 正常組與骨質(zhì)疏松性髖部骨折組兩組間的miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 變化對比分析（）

注：*與血清檢查結(jié)果對比并無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 分析miRNA-21-5p、miRNA-122-5p對疾病的敏感度、特異度及準確性

miRNA-21-5p、miRNA-122-5p對疾病的敏感度、特異性及準確性明顯更高，詳見表3所示。

表3 miRNA-21-5p、miRNA-122-5p 對疾病的敏感度、特異度及準確性分析（%）

3 討論

近年來，受到我國人口老齡化等多種因素的影響，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥患病率逐年增長，同樣，隨著我國老齡化進程的加快，我國骨質(zhì)疏松癥患者的發(fā)病率遠高于臨床統(tǒng)計的數(shù)字，而作為最嚴重的骨質(zhì)疏松性骨折，髖部骨折是近年來我國常見的骨折疾病，發(fā)病率同樣呈逐年增長的趨勢。骨質(zhì)疏松癥是臨床常見全身骨骼疾病，在出現(xiàn)骨量降低及骨組織微結(jié)構(gòu)損傷后導(dǎo)致患者骨脆性的增加，容易導(dǎo)致骨折的發(fā)生[2-3]。同時，在骨質(zhì)疏松患病率逐年增長后，由于骨質(zhì)疏松引起的骨折等多種疾病也在不斷提高，甚至部分患者出現(xiàn)致殘或致死，而骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為當前全球關(guān)注的重點。一般情況下，在女性患者絕經(jīng)后可見，患者受到雌激素水平下降的影響，患者體內(nèi)骨重建的活躍及失衡容易導(dǎo)致小梁骨變細或斷裂，最終導(dǎo)致皮質(zhì)骨孔隙度增加，降低骨強度[3]。此外，當患者體內(nèi)的雌激素水平降低時，患者的骨骼對力學(xué)刺激敏感性相對更低，這就導(dǎo)致了患者出現(xiàn)骨丟失等的病理改變。而患者年齡增長及雌激素降低的同時可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)持續(xù)低度活化，最終使身體處于促炎性狀態(tài)，加重了骨重建失衡癥狀。

miRNA首次在秀麗新小桿線蟲的線粒體中被發(fā)現(xiàn)，在此之后，大量的miRNA被鑒定和研究，部分miRNA在細胞外，通常被稱為循環(huán)miRNA或胞外miRNA，在各種生物液體或細胞培養(yǎng)基中均可發(fā)現(xiàn)，此類miRNA可參與細胞的調(diào)節(jié)與細胞間的通訊[4]。此外，大量研究表明miRNA能夠直接參與到細胞的生長、分化等一系列的過程中，特定miRNA水平的改變與多種疾病有關(guān)，miRNA表現(xiàn)出的高度時間和空間特異性表明其可作為評估疾病發(fā)生發(fā)展的可靠指標[5]。既往研究已顯示，骨質(zhì)疏松癥及其骨折的發(fā)生與否主要由基因決定，miRNA與骨質(zhì)疏松等多種11代謝性疾病的相關(guān)性，在病理條件下，異常的miRNA信號網(wǎng)絡(luò)被證實可參與原發(fā)性和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松等疾病的發(fā)生與進展[6]。miRNA能夠參與到骨代謝中，同時能夠在遺傳中有一定的作用，其能夠在一定程度上影響到細胞的分化方向，同時能夠誘導(dǎo)靶miRNA特異性結(jié)合，導(dǎo)致其發(fā)生降解或翻譯抑制。與此同時，miRNA含量降低或上升的狀態(tài)下患者體內(nèi)的靶基因表達水平也會受到一定程度的影響，從而引起多種臨床癥狀的發(fā)生[7]。有學(xué)者研究表明，骨質(zhì)疏松與miRNA代謝紊亂狀態(tài)有較高的相關(guān)性，miRNA表達水平的變化可影響到骨代謝信號通路發(fā)生變化，miRNA能夠利用成骨分化、破骨細胞分化的調(diào)節(jié)從而改善人體的骨代謝能力，并且，骨質(zhì)疏松與miRNA異常表也與骨代謝有著緊密的聯(lián)系[8]。此外，miRNA的表達與高骨吸收之間也存在一定的功能聯(lián)系，能夠拮抗人體骨髓間充質(zhì)干細胞中的miRNA以提高破骨細胞的分化能力，提示miRNA調(diào)節(jié)骨吸收有一定影響[9]。細胞分化回一個較為復(fù)雜的生理過程，而調(diào)節(jié)細胞的特征性表達則與轉(zhuǎn)錄因子的變化有著一定關(guān)聯(lián)，通過miRNA活性調(diào)節(jié)則能夠幫助提高轉(zhuǎn)錄因子表達的能力，同時又能夠調(diào)節(jié)細胞的變化生理過程[10]。更有研究學(xué)者表明，基因多態(tài)性能消除一個miRNA結(jié)合位點，并能夠創(chuàng)建一個新的位點幫助改變miRNA靶蛋白的表達情況，而miRNA啟動子中的3處發(fā)生的自然的基因多態(tài)性則被證明可能與白種人股骨頸骨密度有一定的關(guān)聯(lián)[11]。而有研究證實，miRNA廣泛存在于機體的血清及血漿中，其能夠耐RNA酶消化等，不會受到患者創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)的影響，同時，血清miRNA能夠隨著患者生理狀態(tài)及疾病病情變化而變化，提示miRNA能夠作為體內(nèi)生理狀態(tài)的無創(chuàng)的實時檢測指標，通過糾正miRNA失調(diào)的miRNA的方式改善患者骨代謝紊亂[12]。

綜上所述，miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平均能夠作為當前骨質(zhì)疏松性髖骨折患者臨床診斷指標之一，通過對miRNA-21-5p、miRNA-122-5p水平的分析能夠?qū)琴|(zhì)疏松等疾病進行預(yù)測及診斷，并可有效觀察患者的疾病嚴重程度，可作為骨質(zhì)疏松性髖骨骨折患者的診斷指標。