前導肽區域N-糖基化影響駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的分泌表達和熱穩定性研究

王楠，楊彩峰，彭華康，郭文芳，王夢琪，李剛強，劉德虎

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

凝乳酶（chymosin）是一種天冬氨酸蛋白酶，來源于未斷奶哺乳動物的胃黏膜細胞，它可以切割κ-酪蛋白中Phe105和Met106之間的肽鍵，使奶中的酪蛋白析出，形成固態[1]。凝乳酶是奶酪工業生產中的重要酶制劑，但通過宰殺哺乳動物幼崽獲取凝乳酶的成本極高，因此，采用微生物重組表達的方法是制備動物凝乳酶的主要方式[2]。重組牛凝乳酶是目前奶酪生產用酶的主要來源。近年研究發現，駱駝來源的凝乳酶對牛乳具有更高的凝乳活性、切割特異性和熱穩定性[3-4]，在降低奶酪的生產和儲運成本、提升奶酪風味方面更具優勢。此外，由于不同動物來源的酪蛋白結構不同，導致牛凝乳酶對駱駝奶無活性，而駱駝凝乳酶可以高效凝固牛奶[3]，因此，駱駝凝乳酶具有更加廣闊的應用前景。畢赤酵母具有遺傳操作簡單、生長速度快、適應高密度發酵以及對人畜無害等諸多優勢，是工業中常用的外源蛋白表達系統[5]。2016年，駱駝凝乳酶已成功在畢赤酵母中重組表達[6]，但發酵液表達量較低，僅為37 mg·L-1，不能滿足工業生產需求。本文嘗試通過對駱駝凝乳酶原蛋白進行N-糖基化修飾，以提高其在畢赤酵母中的表達量，進而為降低駱駝凝乳酶的生產成本、促進產業化應用提供新的研究思路。

N-糖基化是真核生物最常見的蛋白質翻譯后修飾方式之一[7]，糖蛋白上的N-糖基化位點是保守的，N-寡糖鏈特異性的結合到新合成多肽的N-糖基化結合位點（Asn-Xxx-Ser∕Thr，Xxx 不能為Pro）的Asn上[7]。N-糖基化能夠顯著地影響蛋白在真核宿主中的表達水平，李劍鳳等[8]研究發現，糖蛋白吸血蝙蝠纖溶酶原激活劑α1（DSPAα1）分子的第117 和第362 位的N-糖基化對其在畢赤酵母中的分泌表達具有重要作用，去糖基化突變體N117Q和N362Q的表達量顯著下降；Tian等[9]使用N-糖基化抑制劑衣霉素處理重組表達乙酰木聚糖酯酶（分子中含有2個N-糖基化位點）的畢赤酵母細胞，發現乙酰木聚糖酯酶的分泌表達量下降18%。銅綠假單胞菌彈性蛋白酶（Psendomonas aeruginosaelastinase,PAE）前導肽的第51 位和第93 位增加N-糖基化位點能夠提高表達量，而第11 和第127位添加N-糖基化位點則降低表達量[10]。人尿激酶原[11]和牛腸激酶[12]的N-糖基化對其在畢赤酵母中的分泌表達水平沒有影響。盡管已有許多實例證實N-糖基化可以影響蛋白表達量，但對于不同的蛋白，這種影響的表現不同，其中的分子機制尚沒有清晰而統一的解釋。N-糖基化除了影響蛋白的表達量以外，對蛋白自身的分子特性也會產生影響，包括酶活和熱穩定性等。例如，重組表達的纖維二糖水解酶，將酶蛋白分子活性位點上的N-糖基化去掉，可以提高酶活[13]。華根霉來源的脂肪酶分子的N-糖基化對其溫度穩定性具有顯著的影響[14]。綜上，N-糖基化對糖蛋白分子的活性、熱穩定性和表達量都可能產生影響。

駱駝凝乳酶原蛋白分子含有365個氨基酸，其中N 端42 個氨基酸是前導肽，前導肽具有自我切割活性[3]。含有前導肽的凝乳酶原全長分子沒有活性，只有在前導肽完成自我切割后，產生的成熟凝乳酶才具有凝乳活性[3,6]。本課題組前期研究發現，成熟肽直接在酵母中重組表達沒有活性，且已報道的重組凝乳酶也均為含有前導肽的酶原形式[3,15-17]，可見，前導肽對凝乳酶重組表達是必需的。成熟的駱駝凝乳酶蛋白序列中含有2個N-糖基化位點（142N和333N），導致酵母重組表達的凝乳酶原在SDS-PAGE 或Western-blot 檢測時，常以2種相近的分子量形式出現，較低分子量為無糖基化形式，較高分子量為低糖基化形式[3,6]。

本研究擬采用N-糖基化的方法，提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達量。由于凝乳酶活性的發揮需要前導肽的自我切除，因此，本研究選擇在前導肽區域進行N-糖基化突變，既可以對表達量產生影響，又不改變成熟蛋白氨基酸序列，因此不影響酶活，以期為提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達量提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和試劑

大腸桿菌克隆載體pEASY-T、Trans10 感受態細胞以及cDNA 合成試劑盒、Green qPCR SuperMix 試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；畢赤酵母表達載體pPIC9K、畢赤酵母表達菌株GS115 和Bis-Tris 4～12%Gel 購自Invitrogen（美國）；各種限制性內切酶和糖苷內切酶PNGase F 購自NEB（美國）；DNA 無縫連接試劑盒購自中美泰和生物技術（北京）有限公司；DNA、蛋白質分子量標準和凝乳酶原兔多克隆抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；堿性磷酸酶標記的兔二抗購自Abcam（美國）；脫脂奶粉購自Sigma（美國）；酵母總RNA 提取試劑盒購自北京原平皓生物技術有限公司；其他生化試劑為國產分析純。

1.2 駱駝凝乳酶原N-糖基化突變體基因及其表達載體的構建

1.2.1 駱駝凝乳酶原N-糖基化突變體基因的構建 根據駱駝凝乳酶原基因Chy序列（GenBank：AJ131677.1）設計突變體基因擴增引物（表1）。本實驗室前期已構建了含有野生型駱駝凝乳酶原（wild）基因的畢赤酵母表達質粒載體（wild-9K）[6]。本研究共構建6 種N-糖基化突變體基因，其中突變體chy11基因的構建方法為：首先以質粒載體wild-9K 為模板，以chy11-F 和chy-R 為引物，PCR擴增第11 位突變的基因片段（引物chy11-F 中帶有突變位點），再以該PCR 產物為模板，以chy-F和chy-R 為引物，PCR 擴增突變體chy11全長基因。突變體chy26基因的構建方法為：以質粒載體wild-9K 為模板，以chy26-2F 和chy-R 為引物進行PCR 擴增（引物chy26-2F 中帶有突變位點），再以該PCR 產物為模板，以chy26-1F 和chy-R 為引物，進行第2輪PCR 擴增，然后以該擴增產物為模板，以chy-F 和chy-R 為引物，進行第3 輪PCR 擴增，獲得突變體chy26全長基因。突變體chy34基因的擴增方法為：首先以wild-9K 為模板，以chy34-F 和chy-R 為引物，PCR 擴增得 到含有 第34 位突變位點的3’端部分基因片段，同時，以wild-9K 為模板，以chy-F 和chy34-R 為引物，PCR擴增得到含有第34 位突變位點的5’端部分基因片段，再以上述兩端PCR 產物等比例混合物為模板，以chy-F 和chy-R 為引物，PCR 擴增，獲得突變體chy34 全長基因。突變體chy35、chy38和chy39的構建方法同chy34。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 含突變體基因的表達載體的構建 引物chy-F和chy-R的5’端含有pPIC9K表達載體NotⅠ位點處的同源序列，采用DNA 無縫連接試劑盒將上述6種突變體基因的PCR產物分別與NotⅠ酶切的pPIC9K 進行重組連接，獲得6 種含突變體基因的表達載體（mchy-9K）。突變基因位于α 因子分泌信號肽和AOX1終止子之間，形成完整的AOX1啟動子-分泌信號肽-突變基因-AOX1終止子表達框。載體DNA 經測序驗證基因已發生突變，DNA測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.3 駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的分泌表達

野生型和突變體凝乳酶原表達載體分別用SalⅠ線性化，采用電擊轉化法轉化至畢赤酵母GS115 菌株的感受態細胞中。電擊儀為Bio-Rad Micropulser Electroporater (Bio-Rad,美國)，主要參數設置為：電壓1 500 V，電阻200 Ω，電容50μF[感受態制備方法和電轉方法參照Multi-Copy Pichia Expression Kit（Invitrogen）操作說明書]。轉化后的感受態涂布于含有0.5 mg·mL-1G418 的YPD 固體培養基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、1.5%瓊脂）平板上，28°C靜置培養3～5 d至陽性克隆出現。將陽性克隆分別挑取至含有0.4 mg·mL-1G418的10 mL BMGY液體培養基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、4%甘油）中，28°C、200 r·min-1震蕩培養48 h，至OD600約為2.0。發酵液10 000 r·min-1離心5 min收集菌體，將菌體重懸于含有0.4 mg·mL-1G418的10 mL BMMY（1%酵母提取物、2%蛋白胨、0.5%甲醇）液體培養基中，28°C、200 r·min-1誘導培養72 h，培養期間每間隔24 h補加0.5%（體積分數）甲醇。發酵液10 000 r·min-1離心5 min收集上清，采用Western-blot 方法[18]對發酵液上清中凝乳酶原蛋白進行定性鑒定，采用ELISA方法[19]對表達量進行相對定量分析。

1.4 駱駝凝乳酶原基因熒光定量PCR

在比較各凝乳酶原突變體在畢赤酵母中的表達量之前，為確定表達量的差異來源于N-糖基化而非基因拷貝數的差異，首先采用相同的轉化方法和相同的G418濃度，篩選陽性轉化子。然后采用熒光定量PCR 的方法對轉化子中凝乳酶原突變體基因的mRNA進行測定和比較分析。具體方法如下：取2 mL 的0.5%甲醇誘導24 h 的發酵液（含0.4 mg·mL-1G418 的BMMY 液體培養基），12 000 r·min-1離心1 min，收集菌體。采用酵母總RNA 提取試劑盒提取總RNA，cDNA 合成試劑盒進行cDNA 的合成，以cDNA 為模板，內參基因為actin，以qPCR-F∕R 和actin-F∕R 為引物（表1），利用Green qPCR SuperMix 試劑盒進行熒光定量PCR，熒光定量PCR 儀為QuantStudio 3 instrument(Thermo Fisher Scientific,美國)。

1.5 重組駱駝凝乳酶原的活性和溫度穩定性測定

為測定前導肽區域突變后是否影響其自切割活性，將重組蛋白的發酵液上清進行酸-中和處理后，測定凝乳活性。凝乳活性測定的底物制備方法為：用10 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH5.5）配制26%（質量體積分數）脫脂奶粉作為底物。凝乳酶原采用酸-中和處理進行活化，具體方法為：野生型和突變體的酵母表達菌株經0.5%甲醇誘導72 h 后，12 000 r·min-1離心1 min，收集發酵液上清；將發酵液上清用1 mol·L-1HCl調pH至2.0，25 ℃靜置2 h，使前導肽在酸性條件下進行自我切割，再用1 mol·L-1NaOH 調pH 至5.5，即為活化后的酶液。取490 μL 底物與10 μL 酶液于2 mL 離心管中，37 ℃緩慢震蕩5 min，如此時乳液凝固，即成熟肽發揮了凝乳活性，表明前導肽具有自我切割活性。溫度穩定性測定是將發酵液上清在梯度溫度（25～65 ℃）下靜置8 h 后，測定其殘余相對凝乳活力，最終確定凝乳酶的溫度穩定性[6]。

2 結果與分析

2.1 6 種突變體駱駝凝乳酶原N-糖基化突變位點分析

借助前導肽原始蛋白序列中既有的Ser 或Thr，將其-2 位置氨基酸突變為Asn，在僅改變1 個氨基酸的情況下，構建成N-糖基化的保守序列Asn-Xxx-Ser∕Thr，目的是盡量減少對原始序列的改變，從而減少對前導肽自切割活性的影響。另外，Asp 的分子結構與Asn 相近，將第26 位的Asp突變為Asn，同時將第28 位的Leu 突變為Thr，形成1 個N-糖基化位點，以增加糖基化位置的多樣性。6種突變體的N-糖基化位點如圖1所示，根據N-寡糖鏈連接到蛋白序列上的位置，分別命名為：chy11、chy26、chy34、chy35、chy38和chy39，對應的氨基酸突變位點分別為：G11N、D26N∕L28T、A34N、V35N、K38N 和Y39N，突變后的位點均形成了N-糖基化保守序列。將突變體基因構建到畢赤酵母表達載體中，經DNA 測序，證明突變表達載體構建成功。

圖1 駱駝凝乳酶前導肽的N-糖基化突變位點Fig.1 Mutant sites of N-glycosylation in the propeptide of prochymosin.

2.2 N-糖基化對駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中分泌表達水平的影響

2.2.1 駱駝凝乳酶原糖基化分析 經甲醇誘導表達后，對發酵液上清進行Western-blot 鑒定，結果（圖2）顯示，所有的突變體均能夠在GS115 中分泌表達（圖2A），與野生型相比，突變體chy11、chy26與野生型的蛋白分子量差異不大，均為2條帶，分子量較大的條帶為低糖基化形式，分子量約為45 kD；較小的為無糖基化形式，分子量約為40 kD。突變體chy34、chy35、chy38和chy39的蛋白分子量達到70 kD 左右，且條帶呈彌散狀，為過度糖基化（hyper-glycosylated）形式的典型帶形。野生型和所有突變體均用糖苷酶PNGase F去糖基化處理后，分子量均下降至40 kD（圖2B），表明突變體分子量和帶形的差異均來自N-糖基化。

圖2 野生型和突變體凝乳酶原Western-blot分析Fig.2 Western-blot analysis of wild and mutant prochymosins

2.2.2 駱駝凝乳酶原分泌表達量分析 對突變體的相對分泌表達量（圖3）分析表明，與野生型相比，突變體chy34、chy35、chy38和chy39的分泌水平顯著提高，其中chy34的分泌水平最高。

圖3 發酵液上清中野生型和突變體凝乳酶原的相對分泌表達量比較Fig.3 Secretion level comparison of wild and mutant prochymosins by western-blot

同時，采用熒光定量PCR 法測定和比較了重組酵母中野生型和突變體基因的轉錄水平，結果（圖4）顯示，野生型和突變體chy11、chy35、chy39的轉錄水平無顯著差異，與chy26、chy34、chy38在P＜0.05 水平上有顯著差異，但差異較小，均不超過1.4 倍。與圖3 相對比可知，mRNA 水平與表達水平無相關性，即表達量的差異不是來源于基因拷貝數以及轉錄水平的差異，而是糖基化的差異。

圖4 熒光定量PCR比較凝乳酶原基因的相對轉錄水平Fig.4 qPCR analysis of the relative mRNA levels of the prochymosin genes

2.3 N-糖基化對駱駝凝乳酶原前導肽自切割活性的影響

如圖5 所示，所有的突變體均表現出凝乳活性（陰性對照為空菌株GS115 的發酵液上清經過同樣的酸-中和處理后的活性測定），表明6 種N-糖基化突變均不影響前導肽的自切割活性。

圖5 凝乳酶原前導肽的自切割活性分析Fig.5 Analysis of autocatalytic cleavage of the propeptide by confirming the milk-clotting acitity

2.4 N-糖基化對駱駝凝乳酶原熱穩定性的影響

N-糖基化除了影響凝乳酶的表達水平外，還可能影響其溫度穩定性。通過測定凝乳酶相對剩余酶活比較了野生型和6 種突變體的溫度穩定性。與野生型相比，6 種突變體的溫度穩定性均有不同程度的提高（圖6）。野生型和突變體在25 ℃保溫8 h 后，凝乳活性均沒有變化；當溫度升高至45 ℃時，野生型相對酶活下降至50%，而6種突變體的活性仍保持100%；當溫度達到50 ℃時，野生型的酶活完全喪失，突變體仍有20%～80%的相對酶活；當溫度達到60 ℃時，所有突變體的相對酶活均喪失。上述結果表明，前導肽區域6種不同位置的N-糖基化突變，均可以提高凝乳酶原的溫度穩定性。

圖6 野生型和突變體凝乳酶原的熱穩定性比較Fig.6 Comparison of thermostability of wild and mutant prochymosins

3 討論

研究表明，N-糖基化對不同的外源蛋白在真核宿主中的表達量會產生不同的影響。即使是同種外源蛋白，不同的N-糖基化位置，也會產生不同的影響。例如，DSPAα1 分子的N-糖基化會提高其在畢赤酵母中的表達量[8]，而彈性蛋白酶PAE 的N-糖基化對表達量的影響與糖基化的位置有關[10]。目前關于N-糖基化影響蛋白表達量的分子機制尚未得到明確的解析，無法預測N-糖基化對表達量的影響方式。本研究為提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中的表達量，構建了在前導肽6 個不同位置添加N-糖基化位點的突變體，發現其中4 個位點（第34 位、第35 位、第38 位、第39 位）能夠顯著提高表達量，表明采用N-糖基化的方法可以提高駱駝凝乳酶原的表達量，且N-糖基化的位置起著關鍵作用。

在6 種N-糖基化突變體中，chy11和chy26的分子量與野生型差別不大，只是低糖基化的比例有所提高，它們的分泌表達量提升不顯著。突變體chy34、chy35、chy38、chy39的分子量顯著增加，表明這4 個突變位點發生了過度糖基化，過度糖基化是糖蛋白進入高爾基體后寡糖鏈被進一步加長導致的[20]，這些蛋白條帶呈現彌散狀，主要是由于過度糖基化寡糖鏈的糖不均一性[21]以及寡糖鏈與蛋白結合后，改變了蛋白質與SDS 的結合[22]，進而改變蛋白在凝膠中的遷移行為所引起的。同時，它們的分泌表達量也顯著提高。其中突變體chy34表達量最高。由此可見，特定位點的N-糖基化是提高駱駝凝乳酶原在畢赤酵母中分泌表達水平的有效方法。

本研究中，盡管突變體chy34、chy35、chy38和chy39的表達量顯著提高，但凝乳酶原只有在前導肽完成自我切割后，才能發揮凝乳活性，因此，在N-糖基化突變后，前導肽仍能保持自切割活性是其工業應用的關鍵。活性測定結果表明，所有的突變均不影響前導肽的自切割。這可能歸功于每種突變體均只突變了1～2 個氨基酸位點，盡量減少對前導肽結構的影響，另外，也可能是前導肽本身與成熟凝乳酶相互作用的自由度較大，個別氨基酸的突變不影響兩者的相互作用，也不影響凝乳酶原的蛋白三級結構。前導肽區域的N-糖基化突變不僅提高了凝乳酶原的分泌表達量，而且不影響活性，因此，在相同的發酵條件下，駱駝凝乳酶原的生產成本也將會降低，有利于工業生產和應用。

溫度穩定性也是凝乳酶生產、運輸和儲藏等環節的重要影響因素。已有許多報道顯示，N-糖基化能夠影響糖蛋白的溫度穩定性[21,23-24]，本研究發現，N-糖基化能夠顯著提高蛋白的熱穩定性，即使chy11和chy26突變體的分泌表達量提高的并不顯著，但它們的溫度穩定性也比野生型有了顯著的提高。這種N-糖基化對溫度穩定性的積極作用，可能是由于糖鏈能夠增加附近氨基酸的結構剛性，使其更不易變性[25]。同時，糖鏈是親水性的大分子，糖鏈的存在使蛋白在水溶液中更加不易于形成沉淀。另外，Dalit 等[26]報道了糖鏈對蛋白質結構穩定性影響的關鍵在于糖鏈的位置，而不是糖鏈的長度，本研究也驗證了這一假說，即突變體chy11和chy26為低糖基化形式，而chy34、chy35、chy38和chy39為過度糖基化形式，但這些糖基化都對溫度穩定性產生了顯著的影響。

綜上所述，駱駝凝乳酶原前導肽特定位點的N-糖基化，能夠顯著提高其在畢赤酵母中的分泌表達水平和溫度穩定性，且不影響前導肽的自我切割。本研究為降低重組駱駝凝乳酶的工業生產成本，擴大畢赤酵母的應用范圍提供了研究基礎，同時也為闡釋N-糖基化影響糖蛋白表達的分子機制提供了新的參考。