白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒的制備及其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)、抗腫瘤活性研究

李偉宏 王風(fēng)云

（河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院， 河南 鄭州450042）

白藜蘆醇是一種主要存在于花生、葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的多酚類成分，可有效抑制肺癌、乳腺癌、白血病、卵巢癌、皮膚癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞增殖［1?2］，尤其是抗卵巢癌活性，正引起醫(yī)藥研究人員重視，該成分可能通過調(diào)控SIRT1、Nrf2 表達(dá)來阻斷STAT3 信號通路活化［3］，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。但該成分溶解度很差，僅為28.3 μg／mL［4］，從而大大限制了其口服吸收生物利用度和抗腫瘤活性［5］。

研究表明，聚合物納米粒在改善中藥活性成分生物利用度、提高藥效等方面具有較大優(yōu)勢［6］。聚乙二醇單甲醚?聚乳酸?乙醇酸共聚物（mPEG?PLGA）由于具有穩(wěn)定性好、生物相容性高等優(yōu)勢，在納米制劑中的應(yīng)用越來越多。本實(shí)驗(yàn)將白藜蘆醇制成mPEG?PLGA 納米粒，再考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，并采用對數(shù)生長期的HO?8910PM 腫瘤細(xì)胞建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型來評價(jià)其抗腫瘤活性，以期為其他相關(guān)制劑開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；RG?18 型磁力攪拌器（河南金博儀器制造有限公司）；MSE125P?CE 型電子分析天平（德國賽多利斯公司）；R?200 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）；PRD?S?027 型超聲儀（深圳市普瑞登科科技有限公司）；Mastersizer 3000 型激光粒度分析儀（英國馬爾文儀器有限公司）；TTL?DCI型氮?dú)獯祾邇x（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；VD?650 型桌上式超凈工作臺（河南鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；KHVORTEX?5 型漩渦混合器（北京中慧天誠科技有限公司）；HSX?1000N 型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海幕斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試劑與藥物 白藜蘆醇原料藥（批號191115，純度95.7%，湖北鑫潤德化工有限公司）；白藜蘆醇對照品（批號111535?201904，純度99.7%，中國食品藥品檢定研究院）。順鉑（批號20201011，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；單甲氧基聚乙二醇?聚乳酸?羥基乙酸共聚物（mPEG?PLGA，乳酸∶羥基乙酸＝75∶25，mPEG、PLGA 相對分子質(zhì)量分別為2 000、30 000，廣州市碳水科技有限公司）；泊洛沙姆188（批號4142071742E，德國BASF 公司）；二甲基亞砜（DMSO，批 號7516389C）、RPMI?1640 培養(yǎng)基（批號2031583611）（美國Sigma?Aldrich 公司）；胎牛血清（批號200920，美國Gibco 公司）。

1.3 動(dòng)物 SPF 級健康BALB／c 裸鼠，體質(zhì)量18～22 g；清潔級SD 大鼠，體質(zhì)量220～240 g，均購自河南省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2016?0001。

1.4 細(xì)胞 人卵巢癌細(xì)胞株HO?8910PM 購自河南省腫瘤研究所，培養(yǎng)至融合度大于80%時(shí)，采用胰蛋白酶消化傳代。

2 方法與結(jié)果

2.1 白藜蘆醇含量測定

2.1.1 色譜條件 Waters C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)加Phenomenex C18預(yù)柱（4 mm×2 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇?水（4∶6）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長306 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 線性關(guān)系考察 稱取白藜蘆醇對照品10.0 mg（避光操作），轉(zhuǎn)移至100 mL 棕色量瓶中，甲醇超聲溶解并定容至刻度，得0.1 mg／mL貯備液，流動(dòng)相稀釋成10.0、5.0、1.0、0.5、0.1、0.05 μg／mL 對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝1.227 5X－0.192 3（r＝0.999 9），在0.05～10 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 供試品溶液制備 取mPEG?PLGA 納米粒混懸液1 mL 至100 mL 棕色量瓶中，加入甲醇超聲破壞納米粒，流動(dòng)相定容至刻度，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察 取同一份mPEG?PLGA 納米粒混懸液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得白藜蘆醇含量RSD 為1.43%，表明該方法重復(fù)性良好。取0.05、1.0、10.0 μg／mL 對照品溶液各6份，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得白藜蘆醇日內(nèi)精密度RSD 分別為0.68%、0.22%、0.14%，日間精密度RSD 分別為1.09%、0.36%、0.43%，表明該方法精密度良好。取9 份mPEG?PLGA 納米粒混懸液，每份0.5 mL，分為3組，每組3份，分別按80%、100%、120%水平加入對照品溶液，加入甲醇超聲處理后流動(dòng)相定容，過0.45 μm 微孔濾膜，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得白藜蘆醇平均加樣回收率分別為99.46%、100.27%、100.06%，RSD 分別為1.34%、1.12%、0.58%。

2.2 mPEG?PLGA 納米粒及其凍干粉制備 采用乳化?溶劑揮發(fā)法。取白藜蘆醇原料藥25 mg、mPEG?PLGA 500 mg，溶于20 mL 丙酮中，作為有機(jī)相；制備0.8%泊洛沙姆188 溶液100 mL，作為水相，將有機(jī)相滴加至水相中，滴畢后超聲處理（功率250 W，每間隔2 s 工作2 s）15 min，在50 ℃下減壓旋蒸以除盡丙酮溶劑，過0.45 μm 微孔濾膜，即得mPEG?PLGA 納米粒，補(bǔ)加蒸餾水至100 mL 作為混懸液。往混懸液中加入6%甘露醇，搖勻后預(yù)凍2 d，待冷阱降至－30 ℃時(shí)立即放入冷凍干燥機(jī)中1 d，即得其凍干粉。

2.3 包封率、載藥量測定 取mPEG?PLGA 納米粒混懸液3 mL 至具塞離心管中，14 000 r／min 離心45 min，取上清液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算游離藥量（W1）；取離心后沉淀物，冷凍干燥后精密稱定質(zhì)量（W）；另取mPEG?PLGA 納米粒混懸液1 mL 至100 mL 棕色量瓶中，加入甲醇超聲處理后流動(dòng)相定容，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算白藜蘆醇總量（W0），測定載藥量、包封率，公式分別為載藥量＝［（W0－W1）／W］ ×100%、包封率＝［（W0－W1）／W0］ ×100%。取3批mPEG?PLGA 納米粒混懸液，測得其平均包封率為84.42%，載藥量為3.84%；凍干粉復(fù)溶后同法測定包封率，測得其平均值為79.46%。

2.4 凍干粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定 取mPEG?PLGA 納米粒混懸液1 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算W0；另取適量，加入6%甘露醇后按“2.2”項(xiàng)下方法制備凍干粉，稱定質(zhì)量（W總），計(jì)算凍干粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，公式為質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝（W0／W總）×100%，測得其平均值為0.32%。

2.5 粒徑、PDI、Zeta 電位測定 取mPEG?PLGA納米粒混懸液3批，每批0.5 mL，分散于4 mL 蒸餾水中，混勻，測定粒徑、PDI、Zeta 電位，結(jié)果見圖1。由此可知，平均粒徑為143.72 nm，PDI為0.121，表明納米粒均一性良好；Zeta 電位為－6.7 mV，表明納米粒表面帶有一定量的負(fù)電荷，有利于制劑穩(wěn)定。再取凍干粉3批，復(fù)溶后測得其平均粒徑為182.15 nm，PDI 為0.147，Zeta 電位為－5.8 mV，見圖2。

圖1 白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒粒徑分布、Zeta 電位Fig.1 Particle size distribution and Zeta potential of resveratrol mPEG?PLGA nanoparticles

圖2 凍干粉粒徑分布、Zeta 電位Fig.2 Particle size distribution and Zeta potential of lyophilized powder

2.6 體外釋藥研究 取凍干粉適量（含15 mg 白藜蘆醇），加入釋放介質(zhì)至3 mL，轉(zhuǎn)移至透析袋（使用前活化，截留分子量14 kDa），兩端扎緊，同法制備等量原料藥溶液，測得白藜蘆醇在0.5%吐溫80 溶液中的溶解度為79.50 μg／mL。為使原料藥達(dá)到漏槽條件，選擇900 mL 0.5%吐溫80 溶液作為釋藥介質(zhì)，于0、0.25、0.5、1、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h 取樣，設(shè)定轉(zhuǎn)速、溫度分別為100 r／min、（37±1）℃，過0.45 μm 微孔濾膜，測定白藜蘆醇含量，計(jì)算累積釋放度，結(jié)果見圖3。由此可知，原料藥36 h 內(nèi)累積釋放度僅為32.68%；mPEG?PLGA 納米粒釋放過程主要分為2個(gè)階段，0～6 h 屬于快速釋藥期，6 h 內(nèi)累積釋放度為47.47%，而6～36 h 屬于緩慢釋藥期，36 h內(nèi)累積釋放度為74.12%。

圖3 白藜蘆醇體外釋藥曲線（n＝6）Fig.3 In vitro drug release curves for resveratrol（n＝6）

2.7 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

2.7.1 分組、給藥與采血 配制原料藥、mPEG?PLGA 納米粒凍干粉的0.5%CMC?Na 混懸液，作為灌胃液（白藜蘆醇質(zhì)量濃度均為5 mg／mL）。取12只禁食約12 h（可自由飲水）的大鼠，拋幣法隨機(jī)分為白藜蘆醇組、白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒組，每組6只，灌胃給藥（40 mg／kg），于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12 h 眼眶后靜脈叢取血各約0.3 mL，引流至肝素浸潤的離心管中，立即于振蕩器上渦旋5 s，3 000 r／min 離心2 min，分離上層血漿，低溫保存。

2.7.2 血漿處理 參考文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道的方法并略作改進(jìn)，血漿室溫解凍后取100 μL，1.0 mL 乙酸乙酯?甲醇（18∶2）混合溶劑溶解，于振蕩器上渦旋3 min，－4 ℃、8 000 r／min 離心15 min，分離出上層有機(jī)相，40 ℃N2揮除有機(jī)溶劑，殘?jiān)尤?00 μL 甲醇，渦旋溶解后進(jìn)樣分析。

2.7.3 線性關(guān)系考察 對照品溶液用甲醇依次稀釋至1 500、1 000、500、100、50、20 ng／mL，分別取100 μL，40 ℃氮?dú)鈸]干，再加入100 μL 空白血漿，渦旋30 s，按“2.7.2”項(xiàng)下方法處理，即得血漿對照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.260 8X－0.092 2（r＝0.994 6），在20～1 500 ng／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.4 專屬性考察 取空白血漿、灌胃給藥12 h后血漿、血漿對照品溶液（20 ng／mL）適量，按“2.7.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖4。由此可知，雜質(zhì)不干擾測定，表明該方法專屬性良好。

圖4 白藜蘆醇HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of resveratrol

2.7.5 方法學(xué)考察 取灌胃給藥0.5 h 后血漿適量，于1、2、3、4、5、6 d 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，保存于－15 ℃冰箱中，測得白藜蘆醇峰面積RSD 為5.84%，表明血漿在6 d 內(nèi)穩(wěn)定性良好。取20、500、1 500 ng／mL 血漿對照品溶液適量，同一天內(nèi)在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得白藜蘆醇峰面積RSD 分別為6.34%、7.94%、8.63%，表明該方法日內(nèi)精密度良好；同法連續(xù)測定6 d，每天1次，測得白藜蘆醇峰面積RSD 分別為9.63%、8.09%、6.38%，表明該方法日間精密度良好。取上述3 個(gè)質(zhì)量濃度血漿對照品溶液各100 μL，氮?dú)獯党袡C(jī)溶劑，加入100 μL 空白血漿，渦旋混勻，按“2.7.2”項(xiàng)下方法處理，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得白藜蘆醇平均加樣回收率分別為95.05%、90.67%、94.66%，RSD 分別為3.93%、7.43%、4.86%。

2.7.6 結(jié)果分析 血藥濃度?時(shí)間曲線見圖5，再采用實(shí)際測得值計(jì)算Cmax、tmax，梯形法計(jì)算AUC，結(jié)果見表1。由此可知，與原料藥比較，mPEG?PLGA 納米粒tmax、t1／2延長（P＜0.01），Cmax、AUC0～t、AUC0～∞升高（P＜0.01），相對生物利用度提高至3.56 倍。

圖5 白藜蘆醇血藥濃度?時(shí)間曲線（n＝6）Fig.5 Plasma concentration?time curves for resveratrol（n＝6）

表1 白藜蘆醇主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for resveratrol（，n＝6）

表1 白藜蘆醇主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（，n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for resveratrol（，n＝6）

注：與白藜蘆醇比較，??P＜0.01。

2.8 抗腫瘤活性研究

2.8.1 荷瘤模型建立 取處于對數(shù)生長期HO?8910PM 細(xì)胞，采用RPMI?1640 培養(yǎng)液（無血清）重懸細(xì)胞密度至2×107／mL，懸液振蕩后于超凈工作臺上按每只0.2 mL 劑量接種于裸鼠背部皮下，繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF 級實(shí)驗(yàn)室。2 周后，接種部位出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)，選擇直徑大于0.4 cm 者進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.8.2 分組、給藥與指標(biāo)檢測 將40 只荷瘤裸鼠隨機(jī)分為空白組（生理鹽水）、陽性組（2 mg／kg 順鉑）、白藜蘆醇組（40 mg／kg）及白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒低、高劑量組（30、40 mg／kg），每3 d灌胃給藥1次，共21 d，每3 d 測量腫瘤短徑（a）、長徑（b），計(jì)算瘤體積V，公式為V＝a·b2·π／6［8］。頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，剝離瘤體，測量瘤重，計(jì)算抑瘤率，公式為抑瘤率＝（1－給藥組平均瘤重／空白組平均瘤重）×100%［8］。

2.8.3 結(jié)果分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白組、陽性組、白藜蘆醇組及白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒低、高劑量組荷瘤裸鼠體質(zhì)量分別增加14.2%、－10.3%、10.8%、7.4%、－2.7%，下降程度均未超15%，說明毒性反應(yīng)較小［9］。隨著時(shí)間延長，空白組荷瘤裸鼠腫瘤生長最快，精神狀態(tài)、活動(dòng)情況最差；白藜蘆醇組、白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒各劑量組荷瘤裸鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況優(yōu)于空白組，隨著劑量增加兩者改善程度更明顯。

圖6 顯示，白藜蘆醇組、白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒低劑量組荷瘤裸鼠瘤體積在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而高劑量組在7 d 后小于白藜蘆醇組（P＜0.01）。

圖6 各組荷瘤裸鼠瘤體積（n＝8）Fig.6 Tumor volumes of tumor?bearing nude mice in various groups（n＝8）

表2 顯示，與空白組比較，白藜蘆醇組、白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒各劑量組荷瘤裸鼠瘤重降低（P＜0.01）；白藜蘆醇組、白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒低劑量組抑瘤率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而高劑量組高于白藜蘆醇組（P＜0.01），同時(shí)體質(zhì)量降低程度明顯低于陽性組，表明它具有低毒高效的特點(diǎn)。

表2 各組荷瘤裸鼠瘤重、抑瘤率比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates of tumor?bearing nude mice among various groups（，n＝8）

表2 各組荷瘤裸鼠瘤重、抑瘤率比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates of tumor?bearing nude mice among various groups（，n＝8）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與白藜蘆醇組比較，＃＃P＜0.01。

3 討論

王敏［7］、王建澤等［8］分別將白藜蘆醇制成自微乳、微乳，口服生物利用度分別提高至131.84%、1.45倍，但改善程度不明顯，而且處方中表面活性劑用量較大，有溶血風(fēng)險(xiǎn)，安全性不可靠；張純剛等［5］將該成分制成固體分散體，雖然生物利用度提高至200%，但該劑型吸濕性較高，穩(wěn)定性也不理想；于琛琛等［9］將該成分制成包合物，生物利用度提高至225.6%，也存在改善空間；楊娟等［10］在引入磷脂復(fù)合物后將該成分制成固體脂質(zhì)納米粒，但制備工藝稍顯復(fù)雜，而且粒徑稍大（218.6 nm）。本實(shí)驗(yàn)所制備的白藜蘆醇mPEG?PLGA 納米粒相對口服生物利用度可提高至3.56倍，與前期報(bào)道比較具有較大的優(yōu)勢，其原因［11?12］為胃腸道黏膜表面的黏液中含有大量黏蛋白，可有效阻止藥物穿透胃腸道進(jìn)入血液循環(huán)，將該成分制成mPEG?PLGA 納米粒后由于其表面親水性大大增強(qiáng)，減弱了黏蛋白對藥物的靜電引力或疏水作用的影響［13］，藥物可順利吸收進(jìn)入血液循環(huán)；該劑型粒徑較小，有利于藥物經(jīng)過腸道中的派伊爾氏結(jié)進(jìn)入血液循環(huán)，實(shí)現(xiàn)藥物高效吸收，同時(shí)增加了藥物比表面積，減少了胃腸道各種酶對藥物穩(wěn)定性的影響，也有助于改善口服吸收生物利用度。

順鉑是治療卵巢癌最有效的藥物之一［14?15］，但其不良反應(yīng)明顯，容易造成小鼠機(jī)體器官損傷。劉青青等［16］報(bào)道，小鼠腹腔注射給予小劑量順鉑（每次1 mg／kg，每周1次，連續(xù)3 周）后不良反應(yīng)相對較低；結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)及小鼠體質(zhì)量下降程度，本實(shí)驗(yàn)選擇順鉑劑量為2 mg／kg（每天3次，連續(xù)3 周）作為陽性組用量。抗腫瘤活性研究結(jié)果表明，mPEG?PLGA 納米粒可提高白藜蘆醇體內(nèi)抑瘤藥效［17?18］，可能與改善后者生物利用度有關(guān)［19?20］，有望將該制劑開發(fā)成抗卵巢癌新藥。