HPLC 法同時測定玉屏風口服液中12 種成分及質(zhì)量一致性評價

岳 超徐普劉柱施貝 張文婷王峰

（浙江省食品藥品檢驗研究院， 浙江 杭州310052）

玉屏風為中醫(yī)扶正固表的經(jīng)典名方，具有益氣、固表、止汗功效，主要用于表虛不固、自汗惡風、面色晄白或體虛易感風邪者，在新冠肺炎治療中作為推薦預(yù)防用藥，目前對該方成分的研究主要涉及皂苷類化合物，劑型大多為顆粒劑［1?4］、湯劑、散劑［3?10］。玉 屏風口服液收載于2020年版《中國藥典》中，大多以單一成分為質(zhì)量控制指標，但該制劑制備工藝復(fù)雜，故上述標準無法準確評價其質(zhì)量一致性。

本實驗以玉屏風口服液為研究對象，考察含量高、易提取并具有調(diào)節(jié)免疫力、解熱、抗炎、鎮(zhèn)痛等作用［11?18］的成分，最終選取黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、槲皮素、毛蕊異黃酮，防風中的麻素苷、升麻素、5?O?甲基維斯阿米醇苷、芒柄花素，白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及蒼術(shù)酮，建立HPLC 法同時測定其含量，并考察17 批樣品的質(zhì)量一致性，以期為更全面合理地評價和控制該制劑質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀，配置G1314F 型DAD 檢測器、G316A 型柱溫箱、G376E型自動進樣器、G312B 型二元泵（美國Agilent 公司）；電子分析天平（萬分之一，瑞士梅特勒?托利多公司）；KH5200DE 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.2 試劑與藥物 升麻素苷（純度96.2%，批號111522?201712）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（純度97.6%，批 號111920?201606）、升麻素（純度100%，批號111710?200602）、5?O?甲基維斯阿米醇（純度97.4%，批號111523?20181）、亥茅酚苷（純度100%，批號111714?200501）、槲皮素（純度98.1%，批 號100081?201509）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（純度99.9%，批號111975?201501）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（純度99.9%，批號111976?201501）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（純度99.9%，批號111978?201501）、蒼術(shù)酮（純度98.0%，批號DST90607?107）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；毛蕊異黃酮對照品（純度100%，成都普思生物科技股份有限公司，批號PS010251）；芒柄花素對照品（純度98.0%，成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號DST91202?011）。黃芪（膜莢）（批號121462?201304）、黃芪（蒙古）（批號120974?201612）、防風（批號120947?201409）、白術(shù)（炒）（批號120925?201611）對照藥材（中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（德國Merck 公司）；甲醇為分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為純化水。玉屏風口服液共17批，均購于線下或線上藥店，具體信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取各對照品適量，甲醇稀釋成含升麻素苷1 067 μg／mL、毛蕊異黃酮葡萄糖苷1 019 μg／mL、升麻素1 246 μg／mL、5?O?甲基維斯阿米醇1 151 μg／mL、亥茅酚苷1 344 μg／mL、毛蕊異黃酮1 167 μg／mL、芒柄花素1 205 μg／mL、槲皮素1 185 μg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ355 μg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ350 μg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ371 μg／mL、蒼術(shù)酮506 μg／mL 的溶液，分別吸取適量至同一量瓶中，甲醇稀釋，即得（各成分質(zhì)量濃度范圍為35.01～67.20 μg／mL）。

2.1.2 供試品溶液 精密吸取本品1.0 mL 至20 mL量瓶中，80%甲醇定容至刻度，搖勻，靜置，取上清液，0.45 μm 有機濾膜過濾，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 分別制備缺黃芪、缺防風、缺炒白術(shù)的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 Waters SunFire C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相水（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～32 min，9%～35% B；32～60 min，35%～80%B；60～65 min，80%～90%B；65～70 min，90% B；70～73 min，90%～9% B；73～75 min，9%B）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測波長300 nm（0～47 min，升麻素苷、升麻素、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、5?O?甲基維斯阿米醇、毛蕊異黃酮、亥茅酚苷、槲皮素、芒柄花素）、220 nm（47～54 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ）、275 nm（54～58 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ）、220 nm（58～75 min，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、蒼術(shù)酮）；進樣量10 μL。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性考察與專屬性試驗 精密吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液各10 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，各成分均達到基線分離，分離度均大于1.5，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constitents

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取不同體積對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以對照品峰面積為縱坐標（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標（X）進行回歸，再將對照品溶液逐級稀釋，以信噪比（S／N）為3 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度為檢出限，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗

2.5.1 精密度 吸取同一份對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分峰面積RSD 分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.12%、亥茅酚苷0.24%、槲皮素0.09%、毛蕊異黃酮0.52%、升麻素苷0.32%、升麻素0.55%、5?O?甲基維斯阿米醇苷0.73%、芒柄花素0.48%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ1.41%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ1.24%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ1.06%、蒼術(shù)酮0.82%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，于0、6、12、20、30、40、50 h 在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得各成分含量RSD 分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.33%、亥茅酚苷0.42%、槲皮素1.02%、毛蕊異黃酮0.84%、麻素苷1.07%、升麻素0.94%、5?O?甲基維斯阿米醇苷0.73%、芒柄花素0.84%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ1.11%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ1.13%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ0.94%、蒼術(shù)酮0.65%，表明溶液在50 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性 取同一批本品（編號YP?8），按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，測得各成分含量RSD 分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.59%、亥茅酚苷0.75%、槲皮素0.73%、毛蕊異黃酮0.94%、麻素苷1.26%、升麻素0.96%、5?O?甲基維斯阿米醇苷0.93%、芒柄花素0.97%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ0.76%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ1.34%、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ1.29%、蒼術(shù)酮0.73%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗 取9 份各成分含量已知的本品（編號YP?8），每份0.50 mL，分別加入0.10、0.20、0.30 mL 對照品溶液各3份，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率（RSD）分別為毛蕊異黃酮葡萄糖苷97.6%（2.45%）、亥茅酚苷95.3%（2.87%）、槲皮素 94.7%（1.18%）、毛蕊異黃酮 97.6%（1.04%）、升麻素苷97.1%（1.60%）、升麻素97.1%（1.60%）、5?O?甲基維斯阿米醇苷100.7%（1.73%）、芒柄花素96.3%（1.99%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ95.8%（2.56%）、白術(shù)內(nèi)酯 Ⅱ 95.3%（2.79%）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ96.6%（3.07%）。

2.7 樣品含量測定 取17 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結(jié)果見表3。由此可知，升麻素苷、毛蕊異黃酮苷、5?O?甲基維斯阿米醇苷、毛蕊異黃酮含量較高；不同廠家、批次樣品中各成分含量之間差異較大，如YP3 與YP7，并且相同廠家不同批次樣品亦然，如YP4 與YP16；所有批次樣品中均未檢出白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。

表3 各成分含量測定結(jié)果（mg／mL）Tab.3 Results of content determination of various constituents

2.8 化學(xué)模式識別

2.8.1 主成分分析 以表3 數(shù)據(jù)為變量，采用SPSS 22.0 軟件進行主成分分析，計算相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻率，提取特征值＞1者，總方差貢獻率見表4，主成分圖分析見圖2，特征值載荷圖見圖3。由此可知，前4 個主成分特征值均＞1，方差累積貢獻率達94.436%；樣品YP6、YP11、YP16 距離原點較遠，可明顯與其他樣品區(qū)分開；與原始變量關(guān)系最密切的目標物為芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮，來自黃芪、防風藥材，對主成分的貢獻較大。

表4 主成分特征值的總方差貢獻率Tab.4 Total variance contribution rates of characteristic values for principal components

圖2 17 批樣品主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis diagram for seventeen batches of simples

2.8.2 聚類分析 以表3 數(shù)據(jù)為變量，采用SPSS 22.0 軟件中的組間聯(lián)接系統(tǒng)聚類法，以平方歐式距離為測度進行聚類分析，結(jié)果見圖4。由此可知，17 批樣品聚為4類，YP3、YP8 為一類，YP6為一類，YP11、YP16 為一類，其余樣品為一類，與圖3 一致；YP3、YP8，YP11、YP16 中各成分含量占比相似，總和最高，與表3 一致，表示模型穩(wěn)定可靠。

圖3 主成分特征值載荷圖Fig.3 Loading diagram for characteristic values of principal components

圖4 17 批樣品聚類樹狀圖Fig.4 Cluster dendrogram of seventeen batches of samples

3 討論

3.1 測定方法優(yōu)化 本實驗分別考察了不同稀釋溶劑（甲醇、乙醇、水、乙腈、80%甲醇、50%甲醇），發(fā)現(xiàn)80%甲醇稀釋時雜質(zhì)干擾少，各成分含量最高。再對供試品、對照品溶液進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ在275 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、蒼術(shù)酮在220 nm 處有最大吸收，其余成分在220、250、300 nm 處均有吸收。為了使各成分色譜峰的峰高協(xié)調(diào)統(tǒng)一，最終確定300 nm 作為主要檢測波長，并選擇“2.2”項下切換程序。

3.2 含量分析 不同批次玉屏風口服液中各成分含量差異較大，其原因可能來自生產(chǎn)工藝和原藥材，其中前者濃縮、醇沉淀、過濾等流程未作參數(shù)規(guī)定，主觀經(jīng)驗依賴性強，個體差異大；后者產(chǎn)地、基源、生長方式、年限、用藥部位、炮制規(guī)格等因素均會影響質(zhì)量一致性［19?23］。本實驗通過主成分分析得到5 個區(qū)分不同批次樣品的關(guān)鍵成分（芒柄花素、升麻素、亥茅酚苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮），可更好地控制其質(zhì)量一致性。

4 結(jié)論

本實驗建立HPLC 法同時測定玉屏風口服液中12 種成分的含量，并進行質(zhì)量一致性評價，該方法簡便、可靠、準確，檢測指標全面，可為該制劑質(zhì)量控制研究提供新思路，也能為提升其質(zhì)量評價標準提供參考。