一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定膽清膠囊中5 種成分

吳 春覃燕 楊慧麗 楊百科伍慶

（1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550001； 2.貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司， 貴州 貴陽(yáng)550001；3.貴州師范大學(xué)山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng)550001）

膽清膠囊是由虎耳草、鳳尾草、大黃等藥材組成的苗藥，具有清熱利濕、舒肝利膽功效［1?2］，方中君藥虎耳草主要成分巖白菜素、沒(méi)食子酸具有保肝利膽功效［3?6］，大黃主要成分大黃酸、大黃酚、大黃素具有導(dǎo)瀉清熱、護(hù)肝作用［7?12］，與該制劑主治功能相吻合。目前，對(duì)膽清膠囊的研究主要集中在TLC 定性鑒別及其單一成分含量測(cè)定上，鮮有多種成分含量測(cè)定的報(bào)道［13?14］。

中藥有效成分復(fù)雜多樣，其相互作用會(huì)對(duì)療效產(chǎn)生影響，具有多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，故僅對(duì)單一成分進(jìn)行檢測(cè)難以對(duì)其安全性、穩(wěn)定性作全面控制［15?23］。一測(cè)多評(píng)法利用有效成分與內(nèi)標(biāo)之間的函數(shù)關(guān)系，只需測(cè)定1 種成分含量即可實(shí)現(xiàn)其他成分含量的測(cè)定，從而降低檢測(cè)成本［15?23］，故本實(shí)驗(yàn)建立該方法同時(shí)測(cè)定膽清膠囊中大黃酸、巖白菜素、大黃酚、沒(méi)食子酸、大黃素的含量，以期為該制劑安全性及質(zhì)量控制研究提供技術(shù)支撐。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100、1260 高效液相色譜儀；AL?104 電子天平；HS6150 超聲波清洗機(jī)。

1.2 試劑 大黃酚（批號(hào)110796?201520）、沒(méi)食子酸（批號(hào)110831?201605）、大黃素（批號(hào)0756?9908，）、大黃酸（批號(hào)0757?9703）對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；巖白菜素對(duì)照品（批號(hào)20170102，純度98%）購(gòu)自北京生物科學(xué)院與技術(shù)公司。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純；水為自制超純水。

1.3 藥物 膽清膠囊（0.3 g／粒，批號(hào)20200202、20200203、20200204），由貴州圣濟(jì)堂制藥有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱；流動(dòng)相0.1%甲酸（A）?甲醇（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取巖白菜素、大黃酸、沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素對(duì)照品適量，甲醇制成貯備液，精密吸取適量，制成分別含巖白菜素0.031 mg／mL、大黃酸0.030 mg／mL、沒(méi)食子酸0.019 mg／mL、大黃酚0.061 mg／mL、大黃素0.023 mg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱(chēng)取本品內(nèi)容物1 g，精密加入25 mL 甲醇，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 按處方工藝分別制備缺大黃、缺虎耳草、缺鳳尾草、缺牛膽汁、缺大黃和虎耳草的陰性樣品，按 “2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度均大于1.5，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various contituents

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下貯備液適量，甲醇依次稀釋成5 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)其質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 各成分線(xiàn)性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一份對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得巖白菜素、大黃酸、沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素峰面積RSD 分別為 1.57%、2.01%、1.96%、2.11%、1.89%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批本品，平行6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得巖白菜素、大黃酸、沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素含量RSD 分別為1.84%、1.68%、0.93%、1.54%、0.98%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、4、8、16、24、36 h 在“ 2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得巖白菜素、大黃酸、沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素峰面積RSD 分別為1.68%、1.26%、1.79%、0.91%、1.94%，表明溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含量已知的同一批本品，平行6份，按100%水平加入對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，巖白菜素、大黃酸、沒(méi)食子酸、大黃酚、大黃素平均加樣回收率分別為98.92%、100.26%、99.62%、98.60%、99.79%，RSD 分別為1.07%、1.20%、1.26%、0.89%、1.05%。

2.3.7 相對(duì)校正因子計(jì)算 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，以大黃酸為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算相對(duì)校正因子fk／s［21?22］，公式為fk／s＝fk／fs＝（CkAs）／（CsAk），其中Ck為其他成分含量，Ak為其他成分峰面積，Cs為內(nèi)標(biāo)含量，As為內(nèi)標(biāo)峰面積，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 各成分相對(duì)校正因子（n＝6）Tab.3 Relative correction factors of various constituents（n＝6）

2.4 耐用性考察

2.4.1 儀器、色譜柱 取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，考察Agilent 1260、Agilent 1100 色譜儀及Diamonsil C18、Agilent ZORBAX C18、Welchrom C18色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響，結(jié)果見(jiàn)表4，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜1.58%）。

表4 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)校正因子的影響Tab.4 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2 色譜峰定位 采用相對(duì)保留時(shí)間法［21?23］。取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5，可知均無(wú)明顯影響（RSD＜1.63%）。

表5 不同儀器、色譜柱對(duì)相對(duì)保留時(shí)間的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative retention time

2.5 樣品含量測(cè)定 取3 批樣品，每批3份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別采用外標(biāo)法、一測(cè)多評(píng)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表6。由此可知，2 種方法所得結(jié)果接近［相對(duì)誤差（RE）＜3%］，表明一測(cè)多評(píng)法可用于含量測(cè)定。

表6 各成分含量測(cè)定結(jié)果（mg／g，n＝3）Tab.6 Results of content determination of various constituents（mg／g，n＝3）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化 預(yù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)供試品、對(duì)照品溶液的保留時(shí)間?吸收強(qiáng)度?波長(zhǎng)3D圖，依據(jù)基線(xiàn)穩(wěn)定性、非峰干擾、最大吸收，將紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為275 nm。再比較不同溶劑、溶劑比、梯度分布對(duì)流動(dòng)相的影響，發(fā)現(xiàn)甲醇洗脫時(shí)峰分離效果較好，并且酸化后可減少尾峰，提高理論塔板數(shù)，最終確定為0.1%甲酸?甲醇。

3.2 內(nèi)標(biāo)選擇 內(nèi)標(biāo)不僅要有明確的治療效果和穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì)，而且需易獲得，價(jià)格低廉。大黃酸是大黃主要有效成分之一，含量較高，保留時(shí)間適中，對(duì)照品廉價(jià)易得，并且色譜峰附近的干擾峰也較少，故選擇其作為內(nèi)標(biāo)。

3.3 方法評(píng)價(jià) 本實(shí)驗(yàn)采用一測(cè)多評(píng)法時(shí)，先進(jìn)行方法學(xué)考察，再對(duì)相對(duì)校正因子、相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該方法具有較好的重復(fù)性，兩者RSD 均小于2%。含量測(cè)定結(jié)果表明，一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的RE 小于3%，表明該方法準(zhǔn)確可靠，可用于含量測(cè)定。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法同時(shí)測(cè)定膽清膠囊中大黃酸、巖白菜素、大黃酚、沒(méi)食子酸、大黃素的含量，發(fā)現(xiàn)該方法具有良好的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性，在缺乏相應(yīng)對(duì)照品的情況下是可行的，可為該制劑質(zhì)量控制研究提供依據(jù)，也能為其他中藥復(fù)方制劑的相關(guān)考察提供全面可靠的評(píng)價(jià)策略。