UPLC?MS／MS 法同時測定通竅耳聾丸中4 種成分

陳 香欒雨毛飛

（1.鎮江市食品藥品監督檢驗中心， 江蘇 鎮江212003； 2.江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江212013）

突發性耳聾是指突然發生的、原因不明的感音神經性聽力損傷，近年來其發病率有升高趨勢，患者也有年輕化趨勢［1?2］。通竅耳聾丸中含北柴胡、龍膽、黃芩、陳皮、蘆薈、青黛、天南星（礬炙）、熟大黃、梔子（姜炙）、當歸、木香、醋青皮，常用于治療突發性耳聾，臨床療效確切，為2020 年版《中國藥典》一部新增品種，該制劑制備工藝為飲片粉末入藥，用水泛丸，干燥后以滑石粉包衣［3］。目前，通竅耳聾丸質量標準中的指標成分僅有龍膽苦苷、黃芩苷［4?6］，也尚無對黃芩苷、龍膽苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 進行含量測定的報道，故本實驗建立超高效液相色譜?串聯質譜（UPLC?MS／MS）法［7?11］同時測定上述4 種成分的含量，以期為該制劑質量控制研究提供可靠的檢測手段。

1 材料

1.1 儀器 KQ?118 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XRS205 型電子分析天平（瑞士Mettler?Toledo公司）；Omni Hubble C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Shimadzu 8050 型超高效液相色譜?三重四極桿質譜儀，配置LC?MS?8040、MS?SPD?M20A 檢測器（日本Shimadzu 公司）。

1.2 試劑與藥物 黃芩苷（批號110715?202122，純度94.2%）、橙皮苷（批號110721?202019，純度95.3%）、龍膽苦苷（批號110770?201918，純度97.1%）、柴胡皂苷A（批號110777?201912，純度94.8%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。通竅耳聾丸分別購自吉林省天光藥業有限公司（批號20200304、20200412、20200507）、長春人民藥業集團有限公司（批號20191214、20200130、20200405）。甲酸、甲醇均為色譜純（美國Tedia公司）；水為純化水（Thermo Scientific Barnstead Genpure 純化水系統制得）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Waters CORTECS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）；流動相水（A）?甲醇（B），梯度洗脫（0～10 min，67% A，33% B；10～19 min，40%A，60%B；19～19.01 min，20%A，80%B）；體積流量0.4 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量1.0 μL。

2.2 質譜條件 電噴霧離子源，正離子檢測；多反應監測（MRM）模式；離子噴霧電壓4.00 kV；鞘氣20 arb；輔助氣8 arb；加熱模塊溫度350 ℃；DL 溫度300 ℃；干燥氣體積流量11.00 L／min；碰撞氣體高純氬氣［2?4］，MRM 條件見表1。

表1 各成分MRM 條件Tab.1 MRM conditions of varioius constituents

2.3 供試品溶液制備 取本品20粒，碾細，混合均勻，精密稱取1.0 g，加入20 mL 甲醇，沸水浴加熱回流1.5 h，室溫冷卻，轉移到50 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm 針頭濾器過濾，棄去1 mL 初濾液，取續濾液，即得。

2.4 對照品溶液制備 精密稱取對照品柴胡皂苷A 10.12 mg、橙皮苷10.20 mg、龍膽苦苷10.04 mg、黃芩苷10.29 mg，甲醇溶解并定容至100 mL，作為貯備液，分別精密吸取10 mL，轉移到100 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，制成質量濃度分別為10.04、10.12、10.20、10.29 μg／mL 的溶液，即得。再依次稀釋2、5、8、10、20倍，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，MRM 圖、總離子流圖分別見圖1～2。

圖1 各成分MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of various constituents

2.5 線性關系考察 取6 個質量濃度對照品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定。以對照品峰面積（Y）對其質量濃度（X）進行回歸，結果見表2，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表2 各成分線性關系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 定量限、檢測限考察 龍膽苦苷、柴胡皂苷A、橙皮苷、黃芩苷分別以特征分子離子峰m／z195.3、619.2、303.0、271.0 為監測離子對進行檢測，在四者質量濃度為10.00 ng／mL 時信噪比（S／N）大 于10，故選擇其作為定量限；為4.00 ng／mL時（S／N）＞3，故選擇其作為檢測限。

2.7 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定6次，測得龍膽苦苷、柴胡皂苷A、橙皮苷、黃芩苷峰面積RSD 分別為1.0%、1.3%、1.2%、1.1%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗 取“2.3”項下供試品溶液，于0、2、4、8、12、16、24 h 在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得黃芩苷、龍膽苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 峰面積RSD 分別為1.35%、1.46%、1.28%、1.79%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.9 重復性試驗 精密稱取本品（批號20200304）1.0 g，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，測得黃芩苷、龍膽苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A 含量RSD分別為0.34%、2.02%、0.85%、1.20%，表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗 稱取本品粉末0.5 g，加入對照品溶液，混勻，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

圖2 各成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of various constituents

表3 各成分加樣回收率試驗結果（n＝3）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝3）

2.11 樣品含量測定 取6 批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”“2.2”項條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果（n＝3）Tab.4 Results of content determination of various constituents（n＝3）

3 討論

3.1 指標成分確定 通竅耳聾丸中北柴胡含柴胡皂苷A［12］，能保護肝臟，緩解神經損傷，具有良好的神經保護作用［13］；龍膽主要成分龍膽苦苷具有保肝、抗炎等功效，可用于治療中耳炎［14?15］；黃芩及其主要成分黃芩苷可明顯抑制模型小鼠耳廓的腫脹，具有體內抗炎作用［16］；陳皮、醋青皮中橙皮苷可抗菌、抗病毒、保護心血管等［17?18］，故本實驗選擇四者進行含量測定。

3.2 分析條件優化 本實驗分別采用甲醇?水、乙腈?水作為流動相，發現前者洗脫時有利于各成分質譜響應。再考察了流動相中加入改性劑對結果的影響，發現在水相中添加甲酸、乙酸、乙酸銨或三乙胺均有助于改善黃芩苷、橙皮苷峰形，但乙酸銨、三乙胺會抑制柴胡皂苷A 質譜信號強度，而甲酸靈敏度高于乙酸。然后，考察了不同體積分數（0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%）甲酸，發現在0.05% 下各成分色譜峰峰形和分離度最理想。

4 結論

本實驗建立UPLC?MS／MS 法同時測定通竅耳聾丸中黃芩苷、龍膽苦苷、橙皮苷、柴胡皂苷A的含量，該方法簡便快速，穩定可靠，靈敏度高，專屬性強，可作為該制劑質量控制研究的關鍵檢測技術，也能為其臨床應用提供理論基礎。