基于TLR4／MyD88／NF?κB 信號(hào)通路探討龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為的影響

趙建軍 彭曉明 李婷婷 朱鑫磊 王偉龍 漆哲寧劉立?

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)， 甘肅 蘭州730000； 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 甘肅 蘭州730000）

焦慮癥是最常見的精神障礙，核心特征包括過度恐懼和焦慮，恐懼是由迫在眉睫的威脅產(chǎn)生，而焦慮是對(duì)未來威脅的一種預(yù)期狀態(tài)［1］。流行病學(xué)顯示，我國焦慮癥的12 個(gè)月患病率為5.0%，終生患病率為7.6%［2］。目前，抗抑郁藥物選擇性5?羥色胺（5?HT）再攝取抑制劑（SSRIs）是治療焦慮癥的一線用藥，但其常伴有頭痛、失眠、性功能下降等不良反應(yīng)［3］。因此，從多角度闡明焦慮癥的病理機(jī)制，發(fā)現(xiàn)新的藥物作用靶點(diǎn)和尋找更有效的抗焦慮方法無疑是值得探索的方向。

近年來，應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥在焦慮癥病理過程中的作用逐漸受到專家學(xué)者的關(guān)注。其中，Toll樣受體4（TLR4）在應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥中扮演極其重要的角色［4］，其可通過髓樣分化因子88（MyD88）依賴途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子?κB（NF?κB），刺激促炎細(xì)胞因子的釋放。研究表明，通過調(diào)節(jié)TLR4／NF?κB 信號(hào)通路，可逆轉(zhuǎn)束縛應(yīng)激誘導(dǎo)的小鼠焦慮行為［5?6］。龍牡安神顆粒是臨床經(jīng)驗(yàn)處方，具有安神定驚、養(yǎng)心健脾功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，龍牡安神顆粒在臨床上治療焦慮癥療效確切，但其具體作用機(jī)制尚不明確［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)焦慮模型，通過觀察龍牡安神顆粒對(duì)焦慮模型小鼠行為學(xué)及TLR4／MyD88／NF?κB 信號(hào)通路的影響，探討其發(fā)揮抗焦慮作用的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性昆明小鼠，8 周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)62001000000621，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2020?0001。小鼠飼養(yǎng)于溫度（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，12 h／12 h 明暗交替的SPF 環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào) SYXK（甘）2020?0009，所有實(shí)驗(yàn)均在09：00至15：00 之間進(jìn)行。

1.2 試劑與藥物 龍牡安神顆粒（龍骨30 g、牡蠣30 g、磁石30 g、珍珠母30 g、遠(yuǎn)志9 g、酸棗仁15 g、合歡皮10 g、首烏藤10 g、甘草10 g、浮小麥30 g、大棗6 g、茯苓12 g、太子參10 g、桂枝6 g、生姜6 g、石菖蒲6 g）為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥配方顆粒，批號(hào)分別為1060433、1052093、1080083、0123753、1105103、1033643、1055633、1035763、1080933、1012623、1081343、1050723、1030843、1045483、1020733、1052113。鹽酸帕羅西汀片（樂友，浙江華海藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20031106，20 mg／片，批號(hào)0000012020）。BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20210814）；TNF?α、IL?1β、IL?6 ELISA 試劑盒（江蘇麥莎實(shí)業(yè)有限公司，批 號(hào) 202201、202201、202201）；TLR4抗體、MyD88 抗體、NF?κB 抗體、p?NF?κB 抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào) BA08313887、AH10163311、BA07072298、BA09108701）；GAPDH抗體（英國Abcam 公司，批號(hào)GR303514?13）；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)210060240）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào)HB170809）。

1.3 儀器 iMark 酶標(biāo)儀（美國Bio?Rad 公司）；5424R 型高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；DNP?9022 型恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國Thermo 公司）；DYCZ?25D 型Western blot 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；DM2500 型顯微鏡（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 模型建立 48 只雄性昆明小鼠隨機(jī)選取8 只作為空白組，其余40 只作為造模組。空白組不束縛，造模組小鼠參考文獻(xiàn)［5，8］ 報(bào)道，采用慢性束縛應(yīng)激法復(fù)制焦慮小鼠模型，將小鼠放入改造過的50 mL 離心管中（管壁有供動(dòng)物呼吸的氣孔），每日束縛2 h，持續(xù)35 d，束縛時(shí)間在09：00～15：00 時(shí)間段內(nèi)隨機(jī)安排。造模第14 天行高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，與空白組比較，若慢性束縛應(yīng)激造模組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂停留時(shí)間減少，則說明造模成功。

2.2 分組及給藥 造模成功的小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組、鹽酸帕羅西汀組（陽性藥）和龍牡安神顆粒高、中、低劑量組，每組8 只。按照成人和動(dòng)物體表面積折算，鹽酸帕羅西汀灌胃劑量為2.6 mg／kg，龍牡安神顆粒 高、中、低劑量為4.16、2.08、1.04 g／kg（臨床等效劑量的2、1、0.5 倍）。從第15 天開始，每天束縛結(jié)束后0.5 h，給藥組灌胃給予相應(yīng)劑量藥物（10 mL／kg），空白組和模型組灌胃給予等量蒸餾水，每天1次，連續(xù)21 d。末次給藥后，各組小鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測（高架十字迷宮、曠場實(shí)驗(yàn)），行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭取全腦，冰上迅速分離海馬。

2.3 檢測指標(biāo)

2.3.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮距離地面50 cm，由2 個(gè)開臂（30 cm×5 cm×0.6 cm）和2個(gè)閉臂（30 cm×5 cm×15 cm）經(jīng)中央平臺(tái)（5 cm×5 cm）垂直交叉組成。測試時(shí)，將小鼠置于中央平臺(tái)，頭朝開臂，記錄5 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入開臂和閉臂的次數(shù)及在各臂停留的時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)后用75%乙醇擦拭迷宮，再將下一只小鼠放入。

2.3.2 曠場實(shí)驗(yàn) 曠場箱（30 cm×30 cm）分為周圍和中央兩個(gè)區(qū)域，中央?yún)^(qū)大小為15 cm×15 cm的小正方形。測試時(shí)，將小鼠置于曠場箱的中央，記錄5 min 內(nèi)小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)及停留時(shí)間。每次實(shí)驗(yàn)后用75%乙醇溶液徹底清潔曠場箱，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 ELISA 法檢測海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平 制備10%小鼠海馬組織勻漿，離心后取上清液，采用ELISA 試劑盒檢測上清液中炎癥因子TNF?α、IL?1β、IL?6 水平，操作過程遵循試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3.4 RT?qPCR 法檢測海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá) 按照RNA 提取試劑盒說明書提取小鼠海馬組織總RNA，然后根據(jù)HifairⅢ1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real?time PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法計(jì)算TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.3.5 Western blot 法檢測海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達(dá) 冰上提取海馬組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉后，加入一抗TLR4、MyD88、NF?κB、GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日TBST 洗膜后加入二抗（1∶6 000），顯影后使用Image Pro Plus 圖像處理軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.3.6 免疫組化法檢測海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá) 組織切片經(jīng)脫蠟處理后，檸檬酸鈉修復(fù)2次，3%過氧化氫孵育15 min，PBS 沖洗3次，用p?NF?κB 抗體（1 ︰ 100）4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染1 min，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照，使用Image Pro Plus 圖像處理軟件分析p?NF?κB 蛋白表達(dá)。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 25.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)性及方差齊性的數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用LSD 法；方差不齊則用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響 與空白組比較，模型組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂停留時(shí)間和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比均減少（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂停留時(shí)間和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比均增加（P＜0.05，P＜0.01），見表2。

表2 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the elevated plus maze test（，n＝8）

表2 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響（，n＝8）Tab.2 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the elevated plus maze test（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.2 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響 與空白組比較，模型組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)及停留時(shí)間減少（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)及停留時(shí)間均增加（P＜0.01），見表3。

表3 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the open field test（，n＝8）

表3 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響（，n＝8）Tab.3 Effects of Longmu Anshen Granules on mice exposed to chronic restraint stress in the open field test（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.3 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平降低（P＜0.01），龍牡安神顆粒低劑量組小鼠海馬組織IL?6 水平降低（P＜0.01），見表4。

表4 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響（ng／L，，n＝8）Tab.4 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus TNF?α，IL?1β and IL?6 levels of mice exposed to chronic restraint stress（ng／L，，n＝8）

表4 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平的影響（ng／L，，n＝8）Tab.4 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus TNF?α，IL?1β and IL?6 levels of mice exposed to chronic restraint stress（ng／L，，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.4 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κBmRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見表5。

表5 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.5 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus mRNA expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表5 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、 MyD88、 NF?κB mRNA 表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.5 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus mRNA expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.5 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒各劑量組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見表6、圖1。

圖1 各組小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白條帶圖Fig.1 TLR4，MyD88 and NF?κB protein bands in mouse hippocampus of each group

表6 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.6 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus protein expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表6 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織TLR4、MyD88、NF?κB 蛋白表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.6 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus protein expressions of TLR4，MyD88 and NF?κB of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.6 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，鹽酸帕羅西汀組及龍牡安神顆粒高、中劑量組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖2、表7。

表7 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.7 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus expression of p?NF?κB protein of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

表7 龍牡安神顆粒對(duì)慢性束縛應(yīng)激小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白表達(dá)的影響（，n＝8）Tab.7 Effects of Longmu Anshen Granules on hippocampus expression of p?NF?κB protein of mice exposed to chronic restraint stress（，n＝8）

注：與空白組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

圖2 各組小鼠海馬組織p?NF?κB 蛋白免疫組化染色圖（×400）Fig.2 Immunohistochemistry of p?NF?κB protein in mouse hippocampus of each group（×400）

4 討論

焦慮癥是一種常見的與各種應(yīng)激源相關(guān)的神經(jīng)精神疾病，急性和慢性應(yīng)激暴露均可誘發(fā)焦慮癥［9］。慢性束縛應(yīng)激是誘導(dǎo)嚙齒動(dòng)物出現(xiàn)焦慮樣行為的可靠方法，能夠模擬慢性壓力對(duì)人類病理生理的影響，在抗焦慮藥物的研究中被廣泛使用。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)抗焦慮藥物效果的經(jīng)典方法。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，慢性束縛應(yīng)激造模14 d后，小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂停留時(shí)間均減少，說明慢性束縛應(yīng)激焦慮模型復(fù)制成功；與模型組比較，使用龍牡安神顆粒干預(yù)21 d后，小鼠進(jìn)入開臂次數(shù)、開臂停留時(shí)間、進(jìn)入曠場中央?yún)^(qū)域次數(shù)和中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間均增加，提示龍牡安神顆粒具有改善慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為的作用。

應(yīng)激反應(yīng)可激活中樞及外周免疫系統(tǒng)，共同促進(jìn)神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生。研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)社會(huì)挫敗應(yīng)激可激活先天免疫系統(tǒng)，招募外周促炎單核細(xì)胞進(jìn)入中樞，增加中樞及外周循環(huán)中促炎細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生［10?12］。此外，外周循環(huán)中的促炎細(xì)胞因子也可以利用迷走神經(jīng)和特定的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)運(yùn)體等多種途徑通過血腦屏障，進(jìn)一步加強(qiáng)中樞神經(jīng)炎癥信號(hào)［13］。有研究發(fā)現(xiàn)，腹膜注射TNF?α 和IL?6 抑制劑可改善大鼠的焦慮樣行為和認(rèn)知功能［14］；海馬區(qū)IL?1β 基因敲除可減輕脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥及焦慮行為［15］。現(xiàn)代藥理研究表明，遠(yuǎn)志、酸棗仁、甘草、小麥、大棗均具有降低中樞促炎細(xì)胞因子水平，保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的作用［16?18］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平升高；龍牡安神顆粒干預(yù)后，小鼠海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6水平降低。以上結(jié)果提示，龍牡安神顆粒改善慢性束縛應(yīng)激小鼠焦慮行為可能與減少海馬組織TNF?α、IL?1β、IL?6 水平有關(guān)。

TLR4 是激活先天免疫系統(tǒng)的重要受體，在神經(jīng)炎癥的產(chǎn)生和小膠質(zhì)細(xì)胞活化中發(fā)揮重要作用［19］。NF?κB 通常以P65 和P50 形成的異二聚體存在于細(xì)胞質(zhì)中，靜息狀態(tài)下無活性，MyD88 是TLR4 向下轉(zhuǎn)導(dǎo)激活NF?κB 的關(guān)鍵銜接蛋白，TLR4可通過MyD88 依賴途徑激活下游NF?κB，活化后NF?κB 被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞核，參與促炎細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與釋放［4，20］。本研究結(jié)果表明，與空白組比較，持續(xù)的慢性束縛應(yīng)激誘導(dǎo)可使模型組小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κB mRNA及蛋白表達(dá)升高，說明慢性束縛應(yīng)激激活了TLR4／MyD88／NF?κB 信號(hào)通路，通過龍牡安神顆粒干預(yù)后，小鼠海馬組織中TLR4、MyD88、NF?κB mRNA 及蛋白表達(dá)均有不同程度降低，提示龍牡安神顆粒發(fā)揮抗焦慮作用的機(jī)制可能與抑制TRL4／MyD88／NF?κB 信號(hào)通路，減少炎性介質(zhì)的釋放和表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，龍牡安神顆粒能改善慢性束縛應(yīng)激小鼠的焦慮行為，其機(jī)制可能與抑制TRL4／MyD88／NF?κB 信號(hào)通路，減少促炎介質(zhì)的釋放和表達(dá)有關(guān)。