18 F?FDG MicroPET 技術評價桂枝茯苓膠囊對大鼠盆腔炎的抗炎作用

孫 蘭 李家春王燕 皇立衛王麗 王振中

（1.江蘇食品藥品職業技術學院， 江蘇 淮安223003； 2.江蘇財經職業技術學院， 江蘇 淮安223003；3.江蘇省原子醫學研究所， 江蘇 無錫214063； 4.江蘇康緣藥業股份有限公司， 中藥制藥過程新技術國家重點實驗室， 江蘇 連云港222001）

盆腔炎性疾病是女性多發性疾病，主要由腹膜、子宮、卵巢等發生感染時所引起的炎癥總稱［1］。由于定位不準確，疾病播散不局限于一個器官，盆腔炎癥疾病很難診斷，延誤診治可能導致慢性盆腔痛、輸卵管卵巢膿腫、不孕癥等永久性后遺癥［2］。除了常規臨床和實驗室檢查外，超聲檢查、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等成像技術也用以診斷盆腔炎癥疾病［3］。正電子發射斷層掃描術（positron emission tomography，PET）在腫瘤學、心臟病學和神經病學中的廣泛應用使其受到越來越多的關注［4?5］。18F?2?氟?2?脫氧?D?葡萄糖（18F?FDG）作為葡萄糖同系物，是MicroPET 診斷和治療癌癥、神經疾病的標準放射性藥物［6?8］。基于活化的炎性細胞對葡萄糖的攝取增加，18F?FDG 被開發為炎癥疾病顯影的顯像劑［9］。

桂枝茯苓膠囊由桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍和桃仁5 種藥材組成，處方源于《金匱要略》桂枝茯苓丸，具有活血化瘀、緩消癥塊的功效，主要用于盆腔炎性疾病、原發性痛經和子宮肌瘤等疾病，臨床療效顯著［10?11］。本實驗采用苯酚膠漿復制大鼠盆腔炎模型，采用MicroPET 技術觀察炎癥子宮對18F?FDG 的攝取水平，以此反映桂枝茯苓膠囊對模型大鼠盆腔炎的改善作用，為桂枝茯苓膠囊臨床治療盆腔炎性疾病提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SD 大鼠，雌性，體質量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2017?0005。大鼠分籠飼養，飼養溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，自由飲水，實驗動物使用許可證號SYXK（蘇）2019?0025，動物實驗已通過江蘇省原子醫學研究所實驗動物倫理委員會的批準（審查號jsinm?39）。

1.2 藥物 桂枝茯苓膠囊（江蘇康緣藥業股份有限公司）；婦科千金片（株洲千金藥業股份有限公司）。

1.3 試劑 苯酚、乙醇（分析純）、甲醇（色譜純）、K2CO3、NaHCO3、水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；18F?FDG 前體（無錫市江原實業技貿有限公司）；注射用水（江蘇四環生物股份有限公司）。腫瘤壞血因子α（TNF?α）、白細胞介素?1β（IL?1β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國eBioscience 公司）。

1.4 儀器 醫用回旋加速器（Sumitomo HM?7型，日立住友重機械建機起重機株式會社）；18F?FDG 專用合成模塊（PET?FDG?IT?Ⅱ型，北京派特生物技術有限公司）；麻醉機（Matrx VMR型，美國Matrx公司）；MicroPET 掃描儀（Inveon型，德國Simens公司）；γ 計數儀、Cyclone?磷屏成像系統（1470型、C431200型，美國Perkin Elmer 公司）；活度計（CURIEMENTOR 3型，德國PTW 公司）；電子天平（AS210型，德國Sartorius 公司）；QMA 柱、C18柱固相萃取小柱（WAT023525 型、Sep?Pak型，美國Waters 公司）。

2 方法

2.1 造模及給藥 60 只大鼠，參考文獻［12］ 報道方法復制大鼠盆腔炎模型。用10% 水合氯醛350 mg／kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分別用碘伏和75%乙醇消毒，下腹部正中切口約2 cm，暴露子宮，由左側子宮向卵巢方向緩慢注入15% 苯酚膠漿0.1 mL（液化苯酚5 mL、黃蓍樹膠粉1 g、甘油2 mL 制成的混合液中加蒸餾水至33.3 mL，配制15%苯酚膠漿），分層關腹，消毒術區。大鼠隨機分為假手術組、模型組、桂枝茯苓膠囊組（0.558 g／kg）和婦科千金片組（1.525 g／kg），其中桂枝茯苓膠囊組、婦科千金片組各12只，假手術、模型組各18 只。造模4 周后開始灌胃給藥，桂枝茯苓膠囊組、婦科千金片組給予相應劑量藥物，假手術組、模型組給予0.5% CMC?Na 混懸液，容量均為10 mL／kg，每天1次，連續給藥28 d。

2.2 子宮組織病理形態觀察 給藥28 d后，脫頸椎處死動物，各組大鼠子宮組織放射自顯影、18F?FDG MicroPET 測定結束后，取子宮固定于10%甲醛溶液，脫水，石臘包埋，切片經HE 染色，光學顯微鏡觀察（1）子宮內膜及固有層腺體上皮細胞有無變性壞死，（2）子宮內膜有無充血水腫及炎細胞浸潤，（3）子宮肌層有無炎細胞浸潤。根據無明顯病變、輕度病變、中度病變、重度病變分別記為0 分、1 分、2 分、3分，計算各組平均分值，分值越高表明盆腔炎性病變程度越嚴重。

2.3 ELISA 法檢測血清IL?1β、TNF?α 水平 給藥第14、28天，各組大鼠脫頸椎處死前，眼眶靜脈層采血1.5 mL 于未加抗凝劑EP 管中，3 000 r／min離心15 min，取上層血清，按試劑盒說明書檢測IL?1β、TNF?α 水平。

2.4 放射自顯影檢測 給藥前假手術組、模型組各取6 只大鼠，給藥后第14天，各組取6 只大鼠通過尾靜脈注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F?FDG，1 h后脫頸椎處死所有大鼠，取出每只大鼠兩側子宮并固定在顯微鏡玻片上，分別將解剖后的子宮進行磷屏顯像放射自顯影，使用OptiQuant 軟件對放射自顯影圖像進行定量，分析18F?FDG 攝取情況，計算各組攝取相對值，公式為攝取相對值＝左側子宮攝取／右側子宮攝取。

2.5 γ 計數 各組大鼠子宮完成放射自顯影檢測后，利用γ 計數儀檢測每只大鼠兩側子宮γ 計數。

2.618F?FDG MicroPET 檢測 各組大鼠給藥第28天，禁食8 h，用異氟醚麻醉大鼠，并通過插管注射11.1 MBq（0.3 mCi）18F?FDG，1 h 后將大鼠俯臥在掃描儀內掃描。在各組大鼠子宮上繪制感興趣區域（ROI），并計算ROI 中的平均標準攝取值（SUV mean，%ID／g）。

2.7 統計學分析 通過Graphpad Prism5.0 軟件進行處理，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 桂枝茯苓膠囊對盆腔炎大鼠子宮組織病理形態的影響 假手術組子宮組織結構正常；與假手術組比較，模型組大鼠子宮組織病理綜合評分升高（P＜0.01），子宮壁有炎性細胞浸潤，內膜水腫、充血明顯；與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠子宮病理綜合評分降低（P＜0.01），內膜充血水腫、炎性細胞浸潤等病理損傷程度明顯減輕，見圖1。

圖1 桂枝茯苓膠囊對大鼠子宮組織病理形態（A）及綜合評分（B）的影響（，n＝6）Fig.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on histopathological morphology（A）and comprehensive scores（B）of rat uterus tissue（，n＝6）

3.2 桂枝茯苓膠囊對盆腔炎大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響 與假手術組比較，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高（P＜0.01）；給藥第14、28天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 桂枝茯苓膠囊對大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL?1β and TNF?α levels（pg／mL，，n＝6）

表1 桂枝茯苓膠囊對大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平的影響（pg／mL，，n＝6）Tab.1 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat serum IL?1β and TNF?α levels（pg／mL，，n＝6）

注：與假手術組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

3.3 桂枝茯苓膠囊對盆腔炎大鼠子宮自顯影的影響 如圖2 所示，給藥前，與假手術組比較，模型組大鼠攝取相對值升高（P＜0.01），表明盆腔炎模型建立成功的。如圖3 所示，給藥第14天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠子宮攝取相對值降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠子宮自顯影（A）及攝取相對值（B）（，n＝6）Fig.2 Uterine autoradiography（A）and relative uptake value（B）of rats in each group（，n＝6）

圖3 桂枝茯苓膠囊對大鼠子宮自顯影的影響（，n＝6）Fig.3 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterine autoradiography（，n＝6）

3.4 桂枝茯苓膠囊對盆腔炎大鼠子宮γ 計數的影響 給藥前及給藥第14天，模型組大鼠左側子宮每分鐘放射性活性高于假手術組（P＜0.01），見圖4A。給藥第14天，與模型組比較，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠左側子宮每分鐘放射性活性降低（P＜0.01），見圖4B。

圖4 各組大鼠子宮γ 計數比較（，n＝6）Fig.4 Comparison of γ?count in rat uterus of each group（，n＝6）

3.5 桂枝茯苓膠囊對盆腔炎大鼠子宮18F?FDG MicroPET 掃描的影響 模型組大鼠雙側子宮MicroPET 掃描圖像的ROI 分析顯示放射性攝取存在顯著差異，左側子宮為（2.672±0.095）%ID／g，而右側子宮為（1.779±0.486）% ID／g，模型組左側子宮攝取值高于假手術組（P＜0.01）；與模型組比較，給藥28 d后，桂枝茯苓膠囊組和婦科千金片組大鼠左側子宮放射性攝取值均降低（P＜0.01），見圖5。

圖5 桂枝茯苓膠囊對大鼠子宮18F?FDG MicroPET 掃描的影響（，n＝6）Fig.5 Effects of Guizhi Fuling Capsules on rat uterus revealed by 18F?FDG MicroPET scanning（，n＝6）

4 討論

盆腔炎性疾病主要包括盆腔腹膜炎、子宮內膜炎等，如治療不徹底，常會引起慢性盆腔痛、輸卵管妊娠等并發癥，給患者的身心健康帶來嚴重危害［13］。中醫認為血瘀是盆腔炎性疾病主要病機，歸為“不孕”“婦人腹痛”等范疇［14］。桂枝茯苓膠囊是臨床治療婦科血瘀證的經典方劑，由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、白芍組成，具有活血調經、化瘀消癥功能，臨床上用于治療痛經、盆腔炎、子宮肌瘤等疾病［15］。現代藥理研究表明，桂枝茯苓膠囊具有抑制子宮平滑肌收縮、抑制炎癥因子、調節免疫、改善微循環等作用［16］。為了進一步驗證桂枝茯苓膠囊對盆腔炎性疾病抗炎作用，本研究采用苯酚膠漿復制大鼠盆腔炎模型。病理結果表明，模型組大鼠子宮壁有炎性細胞浸潤，內膜水腫、充血明顯；桂枝茯苓膠囊組大鼠內膜充血水腫、炎性細胞浸潤等病理損傷程度明顯減輕，子宮病理綜合評分降低，結果提示，桂枝茯苓膠囊對盆腔炎模型大鼠具有抗炎作用。

IL?1β、TNF?α 是主要促炎細胞因子，在炎癥早期階段，體內TNF?α 水平升高，激活淋巴細胞、中性粒細胞等向病變部分遷移，進而促進IL?1β、IL?6 等多種炎性因子的合成釋放［17］。IL?1β 是體內重要的炎性介質，是促進體內白細胞浸潤的主要細胞因子［18］。研究顯示，桂枝茯苓膠囊通過降低TNF?α、IL?2 水平以發揮治療盆腔炎性疾病的作用［19?20］。牡丹皮、白芍中丹皮酚具有鎮痛、抗炎作用，可以降低子宮內膜異位癥大鼠血清中IL?6、IL?1β 細胞因子水平［21］；桃仁中苦杏仁苷通過抑制一氧化氮合酶的表達，發揮抗炎作用可有效緩解炎性痛［22］；茯苓中齊墩果酸通過調節MAPK 信號通路抑制巨噬細胞炎性因子的表達［23］。本研究結果顯示，模型組大鼠血清IL?1β、TNF?α 水平升高；桂枝茯苓膠囊干預后，血清IL?1β、TNF?α 水平降低，結果提示，桂枝茯苓膠囊能夠減輕大鼠盆腔炎癥反應，與前述文獻報道結果相符。

應用MicroPET 技術評價桂枝茯苓膠囊治療盆腔炎性疾病的研究較少報道，18F?FDG 是MicroPET技術常用的炎癥診斷顯像劑［24?25］。當有炎癥反應時，機體炎癥細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等代謝增強，攝取葡萄糖相應增加，通過MicroPET 技術可觀察病變部位對葡萄糖的攝取量差異來診斷機體炎癥疾病發展的嚴重程度，攝取值越高，提示炎癥越嚴重［26?27］。研究結果表明，模型組左側子宮攝取值高于假手術組（P＜0.01）；桂枝茯苓膠囊給藥28 d后，大鼠左側子宮放射性攝取值均降低（P＜0.01）。結果提示，桂枝茯苓膠囊對盆腔炎模型大鼠子宮炎癥具有一定的保護作用。

綜上所述，本研究成功地復制了大鼠盆腔炎模型，并使用放射自顯影、γ 計數和MicroPET 方法評價了桂枝茯苓膠囊的抗炎作用，結合桂枝茯苓膠囊對盆腔炎模型大鼠子宮組織病理及炎性因子IL?1β、TNF?α 的影響，18F?FDG MicroPET 技術能有效評價桂枝茯苓膠囊對盆腔炎模型大鼠子宮損傷的改善作用。