金沸草化學成分的研究及其對HaCat 細胞的影響

董明亮 馬新蘋 郭金蘭 甘才斌 張步鑫

（1.新鄉市中心醫院， 新鄉醫學院第四臨床學院， 河南 新鄉453000； 2.河南省中醫院， 河南中醫藥大學第二附屬醫院， 河南 鄭州450002）

金沸草為菊科植物旋覆花Inula japonicaThunb.的干燥地上部分［1］，分布于海拔150～500 m 的丘陵、荒地、路旁、山地密林間。金沸草味咸，性溫，具有疏肝氣、化痰飲、消腫毒的功效［2］。其主要化學成分為萜類、黃酮類、烯酮、醌類、有機酸等［3］。金沸草具有抗真菌、保肝、抗腫瘤、抗衰老、保護神經等活性［4?5］。對金沸草有效部位進行分離鑒定出15 個化合物，均為首次從金沸草中分離得到，其中化合物1、11、13、15 對角質形成細胞株（HaCat 細胞）具有不同程度的抑制作用。

1 材料

Thermofisher DQ 型質譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Bruker QA?500P 型超導核磁共振譜（德國Bruker 公司）；KTH?163 型旋轉蒸發儀（鄭州予達儀器有限公司）；SephadeX LH?20 凝膠（瑞典Pharmacia 公司）；HBS?1096A 型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；PAUT1250NA 型全自動離心機（蚌埠谷雨分離機械制造有限公司）；BSA6202S?CW 型電子天平（德國賽多利斯公司）；DMSO 培養基（北京安諾倫生物科技有限公司）。所用試劑均為分析純。

金沸草購自新鄉市中心醫院，經河南省中醫院張步鑫副教授鑒定為金沸草Inula japonicaThunb.。

2 提取與分離

取金沸草33.7 kg，回流提取3次，回收溶劑得金沸草浸膏4.7 kg。依次用石油醚、二氯甲烷、丙酮和正丁醇萃取，濃縮至浸膏，得石油醚層（Fr.A）306.5 g、二氯甲烷層（Fr.B）283.6 g、丙酮層（Fr.C）203.8 g、正丁醇層（Fr.D）236.5 g。Fr.B4 經硅膠柱色譜，以石油醚?丙酮（90∶10～50∶50～10∶90）梯度洗脫，得到Fr.B4?1～Fr.B4?7。Fr.B4?4 經硅膠柱色譜，以石油醚?乙酸乙酯（30∶70）洗脫，得化合物1（12 mg）、9（23 mg）、10（18 mg）。Fr.B7 經硅膠柱色譜，以石油醚?乙酸乙酯（70∶30～50∶50～30∶70）梯度洗脫，得到Fr.B7?1～Fr.B7?6。Fr.B7?5 經Sephadex LH?20 柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物8（16 mg）、12（24 mg）。Fr.B9 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（60∶40～40∶60）梯度洗脫，得Fr.B9?1～Fr.B9?7。Fr.B9?3 經Sephadex LH?20柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物11（17 mg）、13（29 mg）。取Fr.C 過硅膠色譜柱，以石油醚?丙酮（80∶20～0∶100）梯度洗脫，得到Fr.C1～Fr.C9。Fr.C3 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（90∶10～70∶30～10∶90）梯度洗脫，得到Fr.C3?1～Fr.C3?9。Fr.C3?4 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷?丙酮（50∶50）洗脫，得化合物2（14 mg）、5（17 mg）。Fr.C3?7 經Sephadex LH?20柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物15（17 mg）、14（21 mg）。Fr.C8 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷?丙酮（80∶20～50∶50～20∶80）梯度洗脫，得到Fr.C8?1～Fr.C8?8。Fr.C8?3 經硅膠柱色譜，以二氯甲烷?乙酸乙酯（50∶50）洗脫，得化合物7（9 mg）、6（25 mg）。Fr.C8?6 經Sephadex LH?20 柱色譜，以二氯甲烷?甲醇（1∶3）洗脫，得化合物3（22 mg）、4（13 mg）。

3 結構鑒定

化合物1：紫色粉末，ESI?MSm／z：765.1［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?2′），7.59（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），6.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.27（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），6.05（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：104.2（C?1），l59.2（C?2），134.7（C?3），180.6（C?4），162.5（C?5），98.4（C?6），165.3（C?7），95.4（C?8），161.2（C?9），103.5（C?10），122.8（C?1′），116.8（C?2′），146.4（C?3′），150.4（C?4′），117.3（C?5′），124.1（C?6′）。以上數據與文獻［6］ mutabiloside 數值基本一致。

化合 物2：黃色粉末，ESI?MSm／z：324.8［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：12.79（1H，s，5?OH），9.51（4H，m，6，7，3′，4′?OH），7.38（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），7.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H?2′），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.59（1H，s，H?3），6.48（1H，s，H?8）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：117.1（C?1），164.3（C?2），101.7（C?3），177.2（C?4），152.4（C?5），131.8（C?6），151.8（C?7），94.2（C?8），151.8（C?9），103.2（C?10），118.5（C?1′），110.4（C?2′），146.8（C?3′），150.2（C?4′），115.3（C?5′），119.2（C?6′）。以上數據與文獻［7］ 6?羥基木犀草素數值基本一致。

化合 物3：黃色粉末，ESI?MSm／z：351.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.73（1H，s，5?OH），7.73（1H，dd，J＝7.8，1.8 Hz，H?6′），7.12（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），7.05（1H，s，H?3），6.76（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.58（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），3.79（3H，s，7?OCH3），3.74（3H，s，3′?OCH3），3.71（3H，s，4′?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：131.5（C?1），165.2（C?2），104.7（C?3），181.6（C?4），161.9（C?5），102.4（C?6），163.8（C?7），92.5（C?8），157.4（C?9），105.7（C?10），123.6（C?1′），108.1（C?2′），154.7（C?4′），113.8（C?5′），119.2（C?6′），55.4（7?OCH3），54.2（3′?OCH3），56.5（4′?OCH3）。以上數據與文獻［8］ 木犀草素?7，3′，4′?三甲醚數值基本一致。

化合 物4：黃色粉末，ESI?MSm／z：397.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.47（1H，s，5?OH），9.48（1H，brs，4′?OH），7.41（2H，s，H?2′，6′），7.18（1H，s，H?3），6.92（1H，s，H?8），4.07（3H，s，7?OCH3），3.84（6H，s，3′，5′?OCH3），3.71（3H，s，6?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.2（C?1），163.7（C?2），104.2（C?3），181.7（C?4），151.6（C?5），128.5（C?6），159.3（C?7），90.2（C?8），151.1（C?9），102.8（C?10），119.6（C?1′），103.7（C?2′），149.5（C?3′），139.2（C?4′），127.3（C?5′），103.7（C?6′），59.3（6?OCH3），57.2（7?OCH3），57.2（3′，5′?OCH3）。以上數據與文獻［9］ 5，4′?二羥基?6，7，3′，5′?四甲氧基黃酮數值基本一致。

化合物5：黃色粉末，ESI?MSm／z：337.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：14.17（1H，s，5?OH），9.91（1H，brs，4′?OH），7.81（2H，d，H?2′，6′），6.93（2H，d，H?3，5′），6.71（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.29（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），3.94（3H，s，7?OCH3），3.81（3H，s，3′?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：146.2（C?1），164.7（C?2），104.6（C?3），174.9（C?4），159.2（C?5），98.1（C?6），166.3（C?7），91.4（C?8），156.8（C?9），103.2（C?10），120.6（C?1′），109.5（C?2′），147.2（C?3′），149.7（C?4′），114.7（C?5′），119.8（C?6′），55.8（7?OCH3），54.6（3′?OCH3）。以上數據與文獻［9］ 5，4′?二羥基?7，3′?二甲氧基黃酮數值基本一致。

化合物6：黃色粉末，ESI?MSm／z：381.2 ［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.93（1H，s，?OH），6.84（2H，s，H?3，6′），6.52（1H，s，H?3′），6.48（1H，d，J＝1.8 Hz，H?8），6.35（1H，d，J＝1.8 Hz，H?6），4.03（6H，s，2′，5′?OCH3），3.97（3H，s，4′?OCH3），3.88（3H，s，7?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：125.2（C?1），161.8（C?2），109.2（C?3），127.3（C?4），161.8（C?5），97.2（C?6），166.1（C?7），91.3（C?8），110.4（C?1′），149.8（C?2′），96.8（C?3′），152.5（C?4′），153.6（C?5′），113.7（C?6′），101.6（C?4a），157.3（C?8a），55.8（7?OCH3），55.8（2′?OCH3），55.1（4′?OCH3），54.9（5′?OCH3）。以上數據與文獻［10］ 5?羥基?7，2′，4′，5′?四甲氧基黃酮數值基本一致。

化合物7：無色針晶，ESI?MSm／z：188.7［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：11.46（1H，s，2?OH），8.27（1H，s，4?OH），6.31（1H，d，J＝1.8 Hz，H?5），6.18（1H，d，J＝1.8 Hz，H?3），2.58（3H，s，1?OCH3），2.51（3H，s，6?CH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：109.8（C?1），166.8（C?2），100.2（C?3），161.6（C?4），113.5（C?5），143.5（C?6），32.8（1?COCH3），24.6（6?CH3）。以上數據與文獻［11］ 2，4?二羥基?6?甲基苯乙酮數值基本一致。

化合物8：黃色粉末，ESI?MSm／z：201.3［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.65（1H，d，J＝7.8 Hz，H?7），7.41（2H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），6.73（2H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），6.29（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），3.78（3H，s，9?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：128.3（C?1），130.2（C?2），116.2（C?3），162.5（C?4），116.2（C?5），130.2（C?6），145.1（C?7），115.2（C?8），168.1（C?9），52.3（9?OCH3）。以上數據與文獻［12］ 對羥基肉桂酸甲酯數值基本一致。

化合 物9：黃色針晶，ESI?MSm／z：215.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：10.20（1H，brs，4?OH），7.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），6.79（1H，d，J＝7.8 Hz，H?7），6.71（2H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），5.63（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8），3.92（1H，q，J＝7.8 Hz，H?1′），1.05（3H，t，J＝7.8 Hz，H?2′）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：124.7（C?1），133.5（C?2），113.5（C?3），142.7（C?4），113.5（C?5），133.7（C?6），142.6（C?7），114.2（C?8），165.8（C?9），59.3（C?1′），13.8（C?2′）。以上數據與文獻［13］ 對羥基肉桂酸乙酯數值基本一致。

化合物10：黃色粉末，ESI?MSm／z：189.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：8.03（1H，d，J＝7.8 Hz，H?3，5），6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?2，6），4.41（1H，q，J＝7.8 Hz，H?2′），1.42（1H，t，J＝7.8 Hz，H?3′）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：123.6（C?1），131.8（C?2），114.9（C?3），159.4（C?4），114.9（C?5），131.8（C?6），168.2（C?1′），59.6（C?2′），15.1（C?3′）。以上數據與文獻［14］ 對羥基苯甲酸乙酯數值基本一致。

化合物11：白色粉末，ESI?MSm／z：401.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：6.91（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6），6.76（2H，d，J＝7.8 Hz，H?17，21），6.72（1H，d，J＝7.8 Hz，H?14），6.59（1H，d，J＝7.8 Hz，H?12），6.56（2H，d，J＝7.8 Hz，H?18，20），6.37（1H，d，J＝7.8 Hz，H?4），5.79（1H，s，H?9）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：199.3（C?1），109.3（C?2），168.1（C?3），106.2（C?4），164.1（C?5），112.7（C?6），141.6（C?7），197.2（C?8），54.3（C?9），102.4（C?10），160.2（C?11），108.3（C?12），156.8（C?13），109.6（C?14），142.8（C?15），129.4（C?16），131.2（C?17），115.4（C?18），158.3（C?19），115.4（C?20），131.2（C?21）。以上數據與文獻［15］ diptoindonesin D 數值基本一致。

化合物12：白色粉末，ESI?MSm／z：245.3［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.48（2H，m，H?3），7.69（2H，m，H?4），3.96（2H，m，H?5），1.17（3H，t，J＝7.8 Hz，H?6）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：159.2（C?1），129.4（C?2），130.6（C?3），129.1（C?4），69.3（C?5），19.1（C?6）。以上數據與文獻［16］ 鄰苯二甲酸二乙酯數值基本一致。

化合物13：黃色油狀物，ESI?MSm／z：669.4［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：13.57（1H，s，5?OH），7.21（3H，m，H?2′，6′，7?），7.09（1H，brs，H?2?），6.94（1H，d，J＝7.8 Hz，H?6?），6.71（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5′），6.68（1H，d，J＝7.8 Hz，H?5?），6.61（1H，s，H?3），6.35（1H，s，H?6），6.18（1H，d，J＝7.8 Hz，H?8?），4.74（1H，d，J＝7.8 Hz，H?1″），3.68（3H，s，3?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：141.2（C?1），163.6（C?2），101.5（C?3），181.7（C?4），157.2（C?5），101.5（C?6），1643.6（C?7），108.3（C?8），157.2（C?9），108.3（C?10），119.4（C?1′），118.6（C?2′），144.2（C?3′），150.8（C?4′），115.7（C?5′），112.6（C?6′），77.2（C?1″），69.5（C?2″），71.3（C?3″），69.2（C?4″），80.3（C?5″），60.8（C?6″），126.7（C?1?），114.6（C?2?），147.1（C?3?），149.3（C?4?），114.6（C?5?），120.6（C?6?），145.7（C?7?），115.3（C?8?），164.9（C?9?），54.8（3?OCH3）。以上數據與文獻［17］ 7?O?feruloylorientin 數值基本一致。

化合物14：黃色粉末，ESI?MSm／z：381.2［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.02（2H，d，J＝6.8 Hz，H?2′，2″），6.91（4H，m，H?6′，6″，5′，5″），4.73（2H，d，J＝4.8 Hz，H?2，6），3.92（8H，m，H?4β，8β），3.24（2H，m，H?1，5）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：134.1（C?1），112.3（C?2），151.3（C?3），148.2（C?4），115.4（C?5），119.3（C?6），86.2（C?7），56.1（C?8），73.4（C?9），134.1（C?1′），112.3（C?2′），151.3（C?3′），148.2（C?4′），115.4（C?5′），119.3（C?6′），86.2（C?7′），56.1（C?8′），73.4（C?9′）。以上數據與文獻［18］ pinoresinol 基本一致。

化合物15：白色粉末，ESI?MSm／z：263.1［M＋Na］＋。1H?NMR（CDCl3，600 MHz）δ：7.63（1H，d，J＝9.6 Hz，H?9），7.38（1H，d，J＝9.6 Hz，H?10），7.27（1H，d，J＝9.6 Hz，H?7），7.24（1H，d，J＝9.6 Hz，H?8），7.08（1H，dd，J＝9.6，4.8 Hz，H?6），6.75（1H，d，J＝9.6 Hz，H?1），6.62（1H，d，J＝9.6 Hz，H?3），3.94（3H，s.，4?OCH3）；13C?NMR（CDCl3，150 MHz）δ：112.3（C?1），158.2（C?2），102.7（C?3），155.1（C?4），130.1（C?5），113.8（C?6），155.4（C?7），119.3（C?8），128.1（C?9），126.1（C?10），116.5（C?4a），138.2（C?8a），136.1（C?10a），122.1（C?4β），59.1（4?OCH3）。以上數據與文獻 ［19］moscatin 基本一致。

4 化合物對HaCat 細胞的影響

取2022 年1～2 月在新鄉市中心醫院確診的尋常型銀屑病患者15例，經患者知情同意，通過環鉆取上臂外側皮損組織，經中性蛋白酶分離獲取原代角質形成細胞，在培養基中孵育，得到第二代角質形成細胞株（HaCat 細胞）。通過MTT 法［20］檢測化合物對HaCat 細胞的影響，取96 孔板，每孔加入約10 000 個HaCat 細胞，分別加入15 μL 化合物1～15（1、4、8 mg／L）、地塞米松（1、4、8 mg／L）、無血清培養基（設為對照組），在培養箱中培養24 h，每孔加入MTT 試劑繼續培養4 h吸棄上清液，加入DMSO 后輕輕振蕩使結晶溶解。采用酶標儀檢測，計算細胞存活率。與對照組比較，化合物1、13、11、15 對HaCat 細胞具有抑制作用（P＜0.05），見表1。

表1 各化合物對HaCat 細胞存活率的影響（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

表1 各化合物對HaCat 細胞存活率的影響（，n＝3）Tab.1 Effects of various compounds on HaCat cells viability（，n＝3）

注：與對照組比較，?P＜0.05。

5 討論

金沸草為臨床常用藥物，外用具有解毒消瘡的作用。不同品種金沸草可明顯減輕炎性細胞對瘡瘍模型豚鼠受損組織皮膚的浸潤，促進皮膚表面的瘡瘍愈合［21］。本研究從金沸草中分離鑒定出15 個化合物，均為首次從金沸草中分離得到。化合物1、11、13、15 表現出不同程度的抑制HaCat 細胞增殖活性作用。本研究豐富了金沸草化學成分的資料庫，為探求抑制皮損部位的角質形成細胞的新藥開發提供參考。