UHPLC?Q?Exactive Orbitrap MS 分析五味消毒飲中化學成分

董萍萍 張加余王紅孫志強王笑代龍?王少平?

（1.濱州醫學院， 山東 濱州264003； 2.山東中醫藥大學， 山東 濟南250300； 3.山東禹澤藥康產業技術研究院有限公司， 山東 德州251200）

近年來國家對于經典名方發布了開發利用的具體政策，2019 年3 月出臺的《古代經典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求公開征求意見》，要求所開發的經典名方與傳統湯劑的物質基礎需保持基本一致［1］。物質基準的研究對于經典名方的開發和利用至關重要。五味消毒飲出自《醫宗金鑒》，具有清熱解毒、消散疔瘡的功效，主治各種疔毒、癰瘡腫毒等，由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁、天葵子等中藥組成，均具有清熱解毒的功效［2?7］。目前，關于五味消毒飲中單味藥的化學成分報道較多，但對于整方以及物質基準的化學成分報道較少，其發揮藥效作用的物質基礎尚不明確，制約了該經典名方的進一步開發。

高分辨率質譜（HRMS）可為化合物的結構鑒定提供豐富的信息，極大地提升了化學成分鑒定效率，成為中藥化學成分鑒定的常用方法［8?12］。其中，UHPLC?Q?Exactive Orbitrap 可進行高分辨率和高質量精度質譜數據采集，保證篩查結果的可靠和準確性。本研究采用UHPLC?Q?Exactive Orbitrap MS 技術，對五味消毒飲煎液的化學物質進行系統分析，進一步為該方的藥效物質基礎、藥效物質傳遞、質量控制等奠定基礎。

1 材料

UHPLC?Q?Exactive Orbitrap 高分辨質譜（配有電噴霧離子源）、XCalibur 2.1 質譜工作站（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；超聲波清洗機（上海比朗儀器制造有限公司）；Waters HSS T3 UPLC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。

蒙花苷（批號111737?201910）、秦皮乙素（批號110741?201908）、綠原酸（批號110753?201916）、阿魏酸（批號110773?201914）、芹菜素（批號110861?201912）、α?細辛醚（批號111638?201906）對照品購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A（批號Y24N8Y49009）、異綠原酸B（批號P25J6F1793）、異綠原酸C（批號P25J6F1794）對照品購自上海源葉生物有限公司；山柰酚（批號K110308）、甘草素（批號MUST?19101611）、咖啡酸（批號MUST?14100803）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司，以上對照品純度均≥98%。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純；水為超純水。

金銀花（批號190615，產地山東），購自山東平邑種植地；紫花地丁（批號190428，產地山西），購自河北安國藥材市場；野菊花（批號190721，產地江蘇）、蒲公英（批號200104，產地江蘇）、天葵子（批號190529，產地安徽）購自安徽亳州藥材市場，經濟南市藥檢所宋希貴主任鑒定均為正品。

2 方法

2.1 五味消毒飲供試品溶液制備 稱取金銀花15 g、野菊花6 g、蒲公英6 g、紫花地丁6 g、紫背天葵子6 g，加18 倍量水浸泡30 min 后煎煮2次，每次30 min，濾液合并濃縮至500 mL，得五味消毒飲煎液。將該煎液進行冷凍干燥，得凍干粉。精密稱取凍干粉0.5 g 于錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲處理30 min，搖勻濾過，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。同法制備各單味藥材樣品。

2.2 對照品溶液制備 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇使溶解，作為混合對照品溶液。

2.3 色譜及質譜條件 Waters HSS T3 UPLC 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相0.1%甲酸（A）?乙腈（B），梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～35 min，5%～95% B；35～40 min，95%～5%B）；體積流量0.25 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量3 μL。檢測模式正負離子；氮氣（純度≥99.99%）分別作為鞘氣和輔助氣體；毛細管溫度320 ℃；蒸發器溫度320 ℃；噴涂電壓3 500／3 200 V（＋／－）；分辨率70 000；高分辨掃描范圍為m／z80～1 200；碰撞能30 eV；dd?MS2分辨率17 500。

2.4 數據處理 采用Thermo Xcalibur 2.1 工作站進行數據采集和處理。為了盡可能多地獲得ESI?MS／MS 碎片離子，選擇強度不低于40 000 的正離子模式和10 000 的負離子模式下的信號峰進行鑒定。根據精確分子質量、元素組成和可能發生的反應，對所有的母離子和碎片離子的分子式進行預測設置。參數設置如下，C ［1?30］，H ［5?60］，O［1?20］，S ［0?2］，N ［0?5］ 和環不飽和雙鍵數（RDB）［3?20］，質量精度誤差在1×10－5以內。

3 結果

首先建立了基于高分辨液質聯用鑒定中藥化學成分的分析策略，進而開展五味消毒飲的化學成分定性研究。（1）根據中英文文獻及網絡數據庫，檢索五味消毒飲及各單味藥材已報道的化學成分，建立該經典名方的化學成分數據庫；（2）通過Orbitrap超高分辨率全掃描采集，在掃描質量誤差小于5×10－6前提下，根據一級質譜提供的精確相對分子質量，運用Xcalibur 2.1 軟件精確推測色譜峰的元素組成和分子式；（3）將未知化合物的二級碎片離子與現有文獻和上述五味消毒飲成分庫對比，初步推測該色譜峰歸屬；對于具有相同元素組成和相似質譜碎片的同分異構體，考察其色譜保留時間，推測色譜峰可能的結構；（4）歸納對照品和已確定的化學成分質譜裂解規律，結合天然產物質譜學一般裂解規律、不飽和度、N 規律、同位素峰度規律等，推測未知化合物的類型和結構。

基于以上研究策略，采用UHPLC?Q?Exactive Orbitrap MS 對供試品溶液和對照品溶液進行分析，得正負離子模式下的總離子流圖。通過分析準分子離子峰、碎片離子信息，結合對照品和文獻報道，共鑒別了61 個成分［13?40］，包括27 個黃酮類、23個酚酸類、2 個香豆素類、5 個含氮類及其他類化合物4 個。其中，12 個成分通過與對照品比對確認，見表1，其總離子流圖見圖1。

圖1 五味消毒飲總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Wuwei Xiaodu Decoction

3.1 黃酮及其苷類成分 主要包括黃酮及其苷類、二氫黃酮及其苷類、多甲氧基黃酮類等。黃酮苷類結構上有糖基取代，黃酮苷元在A，B 環上常有羥基、甲基、甲氧基等取代基。因此，黃酮苷類化合物在裂解過程中，主要通過高能的碰撞失去糖基，形成豐度較高的黃酮苷元離子。而黃酮苷元則進一步裂解丟失側鏈取代基和羰基，黃酮母核C 環則發生逆狄爾斯?阿爾德（RDA）裂解生成一系列特征離子峰［36］。以芹菜素為例，在負離子模式下產生準分子離子峰m／z269.05，推測其結構式為C15H9O5；其失去羰基形成m／z241.05 的特征碎片離子，繼續丟失一分子氧形成碎片離子m／z225.06。對于黃酮類結構的識別最有意義的碎片離子離子是在1，3 位置由RDA 裂解生成的1，3A1（m／z151.00）和1，3B1（m／z117.03）離子，通過對比芹菜素對照品的保留時間和二級碎片離子確定為芹菜素，其裂解途徑及二級質譜見圖2。化合物47 在保留時間10.30 min 形成較強的色譜峰，在負離子模式下形成m／z445.08 的［M?H］－分子離子峰并進一步脫去1 分子葡萄糖醛酸殘基（m／z176）形成m／z269.04 的苷元成分，并碎裂成m／z117.03、m／z151.00 等碎片，推測其為芹菜素的葡萄糖醛酸化產物。

圖2 負離子模式下芹菜素質譜裂解途徑（A）及其二級質譜圖（B）Fig.2 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of apigenin in negative ion mode

二氫黃酮類化合物具有黃酮2、3 被氫化的基本母核，由于C 環為具有半椅式結構的非平面型結構，水溶性稍大，因此保留時間比一般的黃酮類化合物偏小。其質譜裂解規律與黃酮相似，但在RDA 裂解過程中更加傾向于產生1，3A1的碎片離子作為基峰［40］。化合物38 在負離子模式下，產生準分子離子峰m／z287.055 05，推測其分子式為C15H11O6。碎片離子m／z135.04 與m／z119.03 分別為特征碎片1，3A1和1，3B1，結合其保留時間，化合物38 被推斷為圣草酚。化合物34 在負離子模式下產生準分子離子峰m／z449.108 15，推測其分子式為C21H21O11，其中性丟失葡萄糖殘基（m／z162）產生苷元m／z287.05，苷元產生與圣草酚相同的碎片離子m／z135.04 與m／z119.03，結合保留時間推測化合物34 為圣草酚?7?O?葡萄糖苷。

3.2 酚酸類成分 大部分酚酸類成分在正離子模式下響應很低，從五味消毒飲中發現了酚酸類成分19個，主要包括奎寧酸酯類成分和其他酚酸類成分。

3.2.1 奎寧酸酯類成分 奎寧酸是日常飲食的常見成分，能夠通過腸道菌群轉化成色氨酸和煙酰胺，為人類必不可少的代謝成分提供了生理源［40］。化合物11 在負離子模式下產生準分子離子峰m／z191.054 76，推測其結構式為C7H11O6，結合碎片離子m／z93.03（C6H5O－）和中性丟失CO2所得碎片m／z147.07（C6H11O4－），推斷其為奎寧酸。化合物1 在正離子模式下產生［M＋H］＋離子m／z123.054 84，其分子式為C6H7ON2，二級碎片離子m／z80.05 和m／z53.04 為［M＋H］＋離子依次丟失CNOH 和CNH 而得，結合文獻［41］ 報道，推斷化合物為煙酰胺。化合物8 在正離子模式下產生準分子離子峰m／z205.096 52，其分子式為C11H13O2N2。二級碎片離子m／z130.06 為準分子離子失去C2H5NO2所得，m／z118.07 為準分子離子失去C3H5NO2所得，結合文獻［18，40］ 報道推斷化合物8 為色氨酸。

奎寧酸常與咖啡酸形成咖啡酸酰奎寧酸酯類成分［17，42］，如綠原酸等廣泛存在于中藥材中。以綠原酸為例，在負離子模式下，產生準分子離子峰m／z353.087 25，推測其結構式為C16H17O9，在二級圖譜中形成m／z191.05 的奎寧酸基峰碎片離子，并生成m／z161.02 和m／z135.04 的咖啡酸特征碎片離子，結合對照品保留時間與二級碎片圖譜，鑒定化合物14 為綠原酸，其負離子模式質譜裂解規律和二級圖譜見圖3。

圖3 負離子模式下綠原酸質譜裂解途徑（A）及其二級質譜圖（B）Fig.3 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of chlorogenic acid in negative ion mode

化合物7、12 和17 在負離子模式下都產生理論質荷比為m／z353.087 81 的準分子離子峰，且都產生了m／z191.05 的碎片離子，以及生成了m／z161.02 或m／z135.04 的碎片離子，與綠原酸裂解途徑相一致，結合保留時間以及文獻 ［17?18，42］ 報道，三者分別被鑒定為1、3、4?咖啡酰奎寧酸。

化合物41、42 和48 在負離子模式下產生［M?H］－離子m／z515.118 40（C25H23O12），同時產生了m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 等奎寧酸和咖啡酸特征碎片，故三者為奎寧酸酯類成分，結合對照品保留時間以及二級質譜圖，三者分別被鑒定為異綠原酸A、B 和C。因此，碎片離子m／z191.05、m／z179.02、m／z161.02 和m／z135.04 可以作為診斷離子對奎寧酸酯類成分進行鑒別。

3.2.2 其他酚酸類成分 化合物6 在負離子模式下，檢測到m／z153.017 96 的準分子離子峰，分子式為C7H5O4，在二級質譜裂解中通過丟失一個·COOH自由基產生m／z108.02 的碎片離子峰，化合物6 鑒定為原兒茶酸。化合物15 在負離子模式下產生m／z179.033 55 的分子離子峰，其分子式為C9H7O4，在其二級質譜中，產生中性丟失CO2后的碎片離子m／z135.04 以及丟失C3H4O2后的碎片離子m／z108.02，結合對照品保留時間以及二級質譜圖，其被鑒定為咖啡酸。化合物28 在負離子模式下產生m／z193.049 47 的準分子離子峰，其結構式為C10H9O4，二級質譜由于丟失·CH3、CO2和·CH3＋CO2而產生m／z178.03、m／z148.95 和m／z133.03 的碎片離子，結合對照品保留時間以及二級圖譜，其被確定為阿魏酸。

3.3 香豆素類成分 從五味消毒飲中發現簡單香豆素類成分2個，為苷元秦皮乙素和其葡萄糖苷秦皮甲素。根據秦皮乙素的對照品保留時間和質譜信息，化合物13 被鑒定為秦皮乙素。化合物9 在負離子模式下產生準分子離子峰m／z339.071 41，其分子式為C15H15O9，在其二級質譜中，中性丟失葡萄糖殘基（m／z162）產生了苷元基 峰m／z177.02，繼而連續丟失CO 產生碎片m／z149.02 和m／z121.03，鑒定為秦皮甲素。其質譜裂解規律和二級質譜圖見圖4。

圖4 負離子模式下秦皮甲素質譜裂解途徑（A）及其二級質譜圖（B）Fig.4 Mass fragmentation behavior（A）and MS／MS spectrum（B）of esculin in negative ion mode

3.4 含氮類化合物 共鑒別5 個含氮類，包括3個核苷，1 個氨基酸和1 個酰胺類化合物。其中化合物1 和8 被鑒定為煙酰胺和色氨酸，化合物2、3、5 為核苷類物質。核苷類物質在質譜中通常會失去核糖殘基（m／z132）而生成嘧啶或嘌呤基峰。化合物2 在負離子模式下生成準分子離子峰m／z243.061 39，計算其分子式為C9H11O6N2。在二級質譜中，碎片離子m／z110.02 比準分子離子峰小132，證明了核糖的存在，其繼續失去一分子CO 形成m／z83.02 的碎片離子，最終化合物2 被鑒定為尿苷。含有氨基的核苷類物質在質譜中常常會失去NH3，化合物5 其負離子模式下準分子離子峰m／z282.083 68 的分子式為C10H12O5N5，在二級質譜中，m／z133.01 為準分子離子峰連續中性丟失核糖殘基（m／z132）和NH3（m／z17）而形成的，結合保留時間鑒定化合物5 為鳥苷。

3.5 其他化合物 鑒別出了寡糖、脂肪酸、苯丙素類成分。化合物4 在負離子模式下準分子離子峰為m／z341.108 34，分子式為C12H21O11，在其二級質譜中產生m／z161.02 和m／z113.02 等碎片離子，結合保留時間，化合物4 被鑒定為蔗糖。化合物60 和61 分別被鑒定為棕櫚酸和油酸，來源于野菊花、蒲公英和天葵子藥材，二者均產生中性丟失CO2后的碎片離子m／z237.22 和m／z211.20。化合物59 在負離子模式下產生 ［M?H］－離子m／z207.101 41，分子式為C12H15O3，在負離子模式下丟失一分子烯丙基得到m／z167.05 碎片離子，同時伴隨脫·CH3后的碎片離子m／z193.09，結合對照品保留時間和二級質譜圖，化合物59 被鑒定為α?細辛醚。

4 討論

經典名方物質基準的研究是順利開發經典名方制劑的關鍵環節［43］，中藥復方中含有較為復雜的化學成分，明確化學成分的組成對于闡明其藥效物質基礎、制定質量標準和進一步研究制備工藝具有重要意義。近年來我國對于五味消毒飲的成分研究多集中在指紋圖譜的建立以及單成分的定量中，五味消毒飲的指紋圖譜對10 種成分進行了含量測定［44］；建立五味消毒飲口服液的HPLC 法特征指紋圖譜，并同時測定6 種主要指標成分的量［45］；采用HPLC 法同時測定五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素4 種活性成分［46］。

本研究采用UHPLC?Q?Exactive?Orbitrap 高分辨質譜對五味消毒飲的物質組成進行研究，比較全方基準物質與單味藥材的質譜數據，通過獲得的準分子離子峰、二級碎片離子峰結合參考文獻和數據庫以及對照品信息共鑒定出61 個化合物，以黃酮類、酚酸類、香豆素類以及含氮類成分為主，其中黃酮和酚酸類成分存在于金銀花、野菊花、紫花地丁，香豆素類成分多來源于紫花地丁，含氮類多來源于天葵子中，說明五味消毒飲物質基準未失去各味藥的主要成分，未產生新的成分。對于五味消毒飲的化學組成進行了較為系統的闡釋，并對藥材來源進行了歸屬，可為深入分析其藥效物質基礎及質量標準的建立提供依據，為五味消毒飲制劑開發提供有力的數據支撐，也為其他經典名方的研究提供了參考。