MAPKs 通路在炎性腸病?結直腸癌中的作用及中藥干預研究進展

朱德偉余群 周利紅 沈云輝?

（1.上海中醫藥大學中藥學院， 上海201203； 2.上海中醫藥大學附屬曙光醫院腫瘤科， 上海201203）

結直腸癌是消化道惡性疾病之一，近年來在發展中國家的發病率呈上升趨勢。炎癥性腸病是結直腸癌的常見誘因，早在20 世紀60 年代，“炎?癌轉化”假說被德國著名病理學家Virchow 提出，后經大量流行病學調查發現，約有20%的癌癥由慢性感染或慢性非可控炎癥狀態引起［1］。慢性非可控炎癥引發癌癥包括慢性食管炎與食管癌、慢性潰瘍性結腸炎與腸癌以及帶有幽門螺桿菌感染的慢性胃炎與胃癌等［2］。組織長期的炎癥細胞浸潤會導致微環境中細胞因子、趨化因子、活性氧氮介質等蓄積，發生氧化應激甚至造成p53 和p16 基因突變等。隨著病程的延長，8 年以上的潰瘍性結腸炎（UC）患者結直腸癌的發病率明顯高于普通人群［3］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路通過三級激酶級聯方式傳遞信號，能被多種物理應激、化學刺激、生長因子、促炎因子和細菌復合物等活化，與炎癥和癌癥的發生發展有密切的關系。中醫藥作為一個巨大的寶庫，對于眾多疾病的防治都有值得挖掘的方面。本文對近年來中藥在潰瘍性結腸炎、炎癌轉化過程、結直腸癌中MAPK 的研究進行總結，為中藥抗炎抗腫瘤研究提供新思路。

1 MAPKs 通路

細胞外信號調控蛋白激酶（ERK）在20 世紀90 年代末首次從豬脂肪母細胞中提取發現，自此MAPK 家族成員陸續被發現并研究，包括MAPKKKs、MAPKKs、MAPKs 這3 大類，其通過將細胞外信號逐級放大并傳送至細胞核內，參與炎癥反應、基因表達、細胞分裂、分化、存活、死亡等生理過程，見圖1。經典的MAPK 信號通路激活方式為MAPKKKs（Raf、TAK 等）受到生長因子（如ITF、EGF）、細胞因子、氧化應激、GTP 結合蛋白（如Rac、Ras）等調控激活后，磷酸化MKK 的絲氨酸／蘇氨酸位點激活MKK，后者將MAPK 的蘇氨酸／酪氨酸雙重磷酸化以激活MAPK［4］。MAPK 主要有ERK1／2（p42／p44）、c?Jun 氨基末端激酶（JNK）／應激激活蛋白激酶（SAPK）、p38MAPK、大絲裂素活化蛋白激酶（BMK1）／ERK5 這4種亞單位。其中，ERK1／2 調控細胞的生長、分化等，過度激活可導致腫瘤的發生，在卵巢癌、結腸癌、乳腺癌中高表達，由MEK1／2 磷酸化酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）位點激活。JNK 過度活化參與關節炎、哮喘等疾病，并促進腫瘤的應激增殖、凋亡、轉移等。p38MAPK 家族中發現了p38α、p38β、p38γ（SAPK3、ERK6）、p38δ（SAPK4）等多種亞單位，在不同組織參與不同反應，介導機體幾乎所有的生理病理過程，包括炎癥反應、細胞生長與凋亡等。ERK5 對于生長因子、應激等引起的細胞周期加快、內皮細胞增殖、血管增殖等過程起著重要作用，其高度活化時可協同細胞惡性轉化，與肝癌、乳腺癌、前列腺癌的發生發展密切相關。機體是一個復雜的整體，信號通路之間可以通過炎癥因子等信號分子互相聯系。STATs、NF?κB 等通路也屬于MAPK 下游的調控信號通路，如p38MAPK 可以增強組蛋白H3 磷酸化以及影響IKK 或p65 活性介導NF?κB信號通路［5?6］。

圖1 MAPK 通路簡介

2 腸炎中的MAPK 信號通路

MAPK 通路激活c?Jun 和c?Fos后，入核形成轉錄因子AP?1，調控腫瘤壞死因子?α（TNF?α）、IL?1、IL?6 等炎性因子的表達等，見圖2。p38 MAPK 信號通路可以介導TNF?α、IL?1、IL?6、IL?8 等炎癥因子的釋放、細胞的調亡以及中性粒細胞活化，還誘導細胞內一氧化氮（NO）的表達，提高胞內誘導型一氧化氮合酶（iNOS）活性，與潰瘍性結腸炎的發生密切相關［7］。被ITF 和EGF 激活后，ERK1／2表達升高，可促進腸上皮細胞分化、增殖來修復腸黏膜，抑制腸上皮細胞凋亡［8］。JNK 通路可以活化AP?1、c?Jun等轉錄因子促進多種炎癥因子水平，研究發現，多種動物炎癥模型經JNK 抑制劑SP600125 干預后，炎癥介質的產生受到抑制［9］。當機體處于非可控性炎癥狀態時，炎癥介質釋放引起原癌基因活化和抑癌基因失活，進而引發腫瘤，從多種信號通路的基因表達研究潰瘍性結腸炎癌變發生的驅動因素是目前的關注熱點。

圖2 腸炎中MAPK 信號通路的作用

2.1 中藥有效成分影響MAPK 通路防治潰瘍性結腸炎 中藥是我國醫藥發展的強大支撐，從中分離化合物以及探究其對疾病的影響，是發現新的治療藥物和現代中藥研究的有效方式。冀凱等［10］發現，穿心蓮內酯化合物CX?10 能夠降低結腸組織中髓過氧化物酶（MPO）活性及TNF?α、IL?6 表達，升高IκBα 表達，同時降低NF?κB p65、p?IκBα 的表達，還能降低磷酸化ERK、磷酸化p38MAPK、磷酸化JNK 蛋白表達。丹皮酚、香菇β?葡聚糖、芒果苷（α?MG）、異甘草素能降低實驗性結腸炎組織中磷酸化ERK1／2、JNK、p38MAPK 水平，緩解組織炎癥［11?14］。蛇床子素、黃芪甲苷、姜黃素、雷公藤多苷能抑制p38MAPK 表達及上下游信號通路，減少相關促炎細胞因子（如TNF?α）的釋放以及中性粒細胞浸潤，從而發揮抗炎作用［15?18］。活性氧（ROS）自由基伴隨潰瘍性結腸炎的發生發展，而中性粒細胞及嗜酸細胞中NADPH 氧化酶（NOXs）能促進ROS 的生成。研究發現，黃連根部提取物香草乙酮通過抑制NOXs的活性來減少ROS 的生成，進而阻斷下游p38MAPK 的磷酸化，從而抑制NO、前列腺素E2（PGE2）及相關細胞因子的生成［19］。微小RNA（miR）?143 是抑癌基因，能調節腸道隱窩中干細胞功能進而調控腸上皮再生，在潰瘍性結腸炎相關的結直腸癌中miR?143 表達降低。ERK5 很可能是miR?143 的下游靶標之一，姜黃素能升高miR?143 表達并降低ERK5 表達，其可能通過調控miR?143／ERK5 信號通路治療葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）誘導的結腸炎［20］。多種中藥單體都可以抑制MAPK 通路的激活、減少炎癥因子的表達來減輕腸道炎癥，見表1。

表1 中藥有效成分調控MAPK 通路防治潰瘍性結腸炎

2.2 中藥復方影響MAPK 通路防治潰瘍性結腸炎 中醫經典名方是兩千年來中華民族的醫藥經驗積累，通過多味中藥的加減配伍應用于各種疾病。現代經方對更多疾病的應用研究進行擴展，經方含有多種藥材，其對機體的調節是復雜的，在MAPK 通路中往往對ERK1／2、JNK、p38MAPK等多種亞單位進行調控，見圖3、表2。參苓白術散作為補脾胃、益肺氣的經典名方被廣泛應用及研究。畢殿勇等［22］采用空腹灌服精煉豬油、饑飽失常飼養結合水中站立等方法，成功復制脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠模型，研究發現，參苓白術散能降低結腸組織p38MAPK 的基因和蛋白表達，并通過阻斷p38MAPK 信號通路，降低IL?1β、升高IL?4 的基因及蛋白表達。脾胃濕熱證的發生伴隨著水通道蛋白（AQP）3、AQP4 的異常表達，李姿慧等［23?24］實驗發現，在脾虛濕困型潰瘍性結腸炎大鼠模型中，參苓白術散可以降低大鼠結腸組織ERK、p38MAPK 表達，其可能通過抑制ERK、p38MAPK 信號通路的激活以調控AQP3、AQP4的表達，有效改善結腸水液代謝功能。劉玉暉等［25］發現，參苓白術散可以通過對ERK／p38MAPK 信號通路的影響起到抗炎癥性腸病的作用，進一步發現，灌胃給予大鼠參苓白術散能抑制LPS 誘導腸隱窩上皮細胞IEC?6 中相關蛋白升高，減少細胞骨架、通透性的改變，從而抗腸上皮細胞損傷。亦有多種復方的抗炎作用經過驗證與MAPK 信號通路相關。蘭茵鳳揚化濁解毒方促使ERK 通路激活，升高ERK mRNA 與蛋白磷酸化水平，促進細胞增殖，加速腸黏膜修復［26］。宋艷琦等［27］發現，化濁清解愈潰 煎能抑制p38MAPK 通路活化，從而通過減少TNF?α 的釋放以及升高抗炎因子IL?4 的表達來抗炎癥。姜小艷等［28］發現，理腸湯能作用于p38MAPK 通路，降低IL?1 等促炎因子釋放。姚玲等［29］觀察腸愈灌腸方對60 例潰瘍性結腸炎患者的療效發現，其能通過調控p38MAPK 信號通路，減少TNF?α 等促炎因子的釋放以及增加IL?10 水平來改善患者病情。Bax基因能誘導細胞凋亡，Bcl?2 能抑制細胞凋亡，Bcl?2 蛋白能與Bax 結合形成穩定的異二聚體抑制細胞凋亡。四神丸通過抑制p38MAPK 信號通路中p38MAPK、p53、caspase?3、c?Jun、c?Fos、Bax、TNF?αmRNA 表達，提高Bcl?2 mRNA 和Bcl?2／Bax比值［30］。白芍七物顆粒劑可降低潰瘍性結腸炎大鼠模型中NOXs、ROS、p38MAPK、IL?1β 表達，其可能通過抑制NOXs?ROS?p38MAPK 信號通路相關基因及蛋白的表達來改善潰瘍性結腸炎［31］。

表2 中藥復方影響MAPK 通路防治潰瘍性結腸炎

圖3 中藥復方通過MAPK 通路防治潰瘍性結腸炎路徑圖

2.3 中藥影響MAPK 通路防治炎?癌轉化 目前對炎?癌轉化中MAPK 通路研究較少，研究多集中在Wnt／β?catenin、STATs 信號通路。婁朝勝等［32］通過化學誘導劑氧化偶氮甲烷／葡聚糖硫酸鈉（AOM／DSS）聯合誘導法，模擬正常黏膜到炎癥到腺瘤以及到腺癌生成的全過程，模型小鼠Toll樣受體4（TLR4）／MAPKS 信號通路激活，靶基因PCNA、COX?2、Bcl?xl 表達升高，腸黏膜TLR4、p?JNK1／2、p?p38、p?ERK1／2、p?NF?κBp65、PCNA、COX?2、Bcl?xL 表升高，促進其下游的NF?κB 通路的活化，灌腸給予小鼠益脾養胃湯藥液后，小鼠血清和結腸組織IFN?γ、IL?12 水平降低，IL?4 水平升高，TLR4、p?JNK1／2、p?p38、p?ERK1／2 mRNA 和蛋白表達降低，p?NF?κBp65、PCNA、COX?2、Bcl?xL 蛋白表達降低，提示益脾養胃湯可以降低TLR4／MAPKS 信號通路的表達，抑制下游NF?κB 的激活，同時降低靶基因PCNA、COX?2 和Bcl?xL 和炎癥細胞因子水平，修復腸黏膜，緩解炎癥來防治潰瘍性結腸炎癌變。Li等［21］發現，香草醛可以降低模型小鼠結腸組織ERK、JNK、p38MAPK 的磷酸化水平，從而抑制炎癥的惡性轉化。

3 MAPK 在炎性腸病相關腫瘤中的作用

3.1 結直腸癌中的MAPK 通路 MAPK 通路調控腫瘤血管新生、細胞凋亡、侵襲和轉移等。與癌旁組織相比，結直腸癌組織中ERK1／2 mRNA，ERK1／2、p?ERK 1／2 蛋白表達升高，且與腫瘤分化程度、淋巴結轉移和TNM 分期密切相關［33］。p38MAPK 與JNK 信號通路根據腫瘤細胞種類及刺激類型等因素具有不同作用及表達。p38MAPK 往往因其在細胞分化、生長抑制和凋亡誘導中的作用而被定義為腫瘤抑制因子，p38MAPK 磷酸化水平升高可以誘導caspase?3 活化，促進其凋亡；但也有研究指出p38MAPK 可以直接磷酸化并抑制caspase?8、caspase?3 活性，有利于腫瘤細胞的增殖［34］。JNK 介導c?Jun 和ERK 磷酸化可以促進腫瘤細胞增殖、抗凋亡；但同樣有研究發現，JNK 還可以調控凋亡相關蛋白Bcl?2、Bax 等促進細胞凋 亡［35?36］。Ras?Raf?MEK?ERK 信號傳導通路介導細胞的增殖、分化、凋亡，與體內腫瘤細胞的增殖 及轉移密切相關，JNK、ERK1／2、p38MAPK 等磷酸化后可影響細胞周期、cleaved?caspase?3、基質金屬蛋白酶等表達。

3.2 中藥介導MAPK 影響結直腸癌 HCT?116 細胞、LoVo細胞、HT?29 細胞、SW480 細胞等是常用的結直腸癌細胞。王志國等［37］通過異甘草素處理HCT?116 細胞，發現異甘草素可升高cleaved?caspase?3 表達，抑制結直腸癌細胞的增殖、侵襲和遷移，誘導細胞發生凋亡，其機制可能與抑制JNK、ERK1／2、p38MAPK 的磷酸化有關。通過光果甘草根和根狀莖的主要疏水活性成分光甘草定處理HCT?116 細胞，發現光甘草定能下調JNK 通路，上調p38 通路，且可能部分通過JNK 通路降低肌球蛋白輕鏈（MLC）的磷酸化水平從而抑制HCT?116 細胞的遷移，而同樣處理人結直腸癌RKO 細胞，細胞中JNK 磷酸化水平先上升后下降，p38 通路升高［38］。PDZ 結合激酶（TOPK／PBK）是MEK 蛋白家族的成員，姜黃素被證實可抑制其活性，降低下游ERK1／2及H3 的磷酸化水平，促HCT?116 細胞凋亡［39］。氯化兩面針堿可降低ERK 的磷酸化水平，降低Bcl?2 表達和升高Bax表達，且與ERK 抑制劑U0126 協同促進HCT?116 細胞的凋亡［40］。Huang 等［41］發現，黃連堿能夠降低HCT?116 細胞中ERK mRNA 及蛋白表達，將HCT?116 細胞注入裸鼠體內并在局部迅速生長為腫瘤后，發現黃連堿可通過MAPK 途徑降低腫瘤組織中癌基因K?ras、TNF?β的轉錄，同時升高抑癌基因p53 的表達。靈芝多糖誘導HCT?116 細胞凋亡的作用可被JNK 通路抑制劑SP600125 降低，LoVo 細胞的凋亡可被ERK 抑制劑、p38MAPK 抑制劑和JNK 抑制劑抑制，表明MAPK 通路參與靈芝多糖誘導HCT?116 細胞、LoVo 細胞凋亡［42?43］。Wang 等［44］通過不同濃度18β?甘草次酸處理大腸癌細胞LoVo、SW480、SW620后，發現腫瘤細胞p?JNK、p?p38MAPK 水平降低，且呈劑量和時間依賴性。研究發現，石蒜堿通過逆轉上皮間充質轉化EMT 過程及調控ERK／MAPK 信號通路，降低磷酸化ERK1／2 水平而抑制LoVo 細胞的生長［45］，還發現其能降低HT?29 細胞Bcl?2、p?ERK、AKT、NF?κB 蛋白表達，升 高 Bax、caspase?3、p38MAPK、JNK 表達來抑制細胞增殖，并誘導其凋亡［46］。表皮生長因子受體（EGFR）與大腸癌的發生、轉移乃至預后等都有密切聯系，抑制其激活可以促進結腸癌細胞凋亡，MAPK 信號通路是EGFR 的主要下游蛋白激酶。熊果酸是抗腫瘤中藥滕梨根主要有效成分之一，其能介導HT?29 細胞 EGFR／MAPK 信號通路，降 低 EGFR、ERK1／2、p38MAPK、JNK 的磷酸化［47］。Li 等［48］發現，牛蒡子苷元可通過增加ROS 水平，激活p38MAPK 通路和線粒體膜電位的變化，且劑量依賴性地增加HT?29 細胞凋亡率。苦豆堿能降低HT?29 細胞中磷酸化的Raf 蛋白和磷酸化ERK1／2的蛋白表達，其可能通過Ras／Raf／ERK1／2 通路抑制細胞增殖，并降低體內移植HT?29 的腫瘤組織內磷酸化ERK1／2蛋白表達來抑制腫瘤生長［49］。桔梗皂苷D 能降低G1期的細胞周期相關蛋白cyclinD1、原癌基因c?myc、周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）的表達將SW620 細胞周期阻滯在G1期，升高caspase?3 表達和剪切其底物PARP 誘發細胞調亡，并且與去磷酸化ERK1／2，激活JNK、p38MAPK 信號通路有關［50?51］。苦參堿處理K?ras基因突變型人結腸癌SW480細胞發現，其可能降低MAPK 通路下游MEK1／2 的表達，抑制細胞生長、增殖，促進凋亡［52］。雷公藤甲素可能通過抑制SW480 細胞中ERK 以及下游基因GABPα mRNA 表達，抑制細胞增殖［53］。中藥有效成分介導MAPK 影響結直腸癌情況見表3。

表3 中藥有效成分通過MAPK 防治結腸癌

4 問題與展望

4.1 MAPK 通路在腫瘤中的作用有待深入研究 在信號通路對機體疾病的調控過程中，各通路上下游信號因子之間相互影響、相互作用，構成復雜的信號網絡。MAPK 通過促進相關基因的表達介導機體的炎癥反應、細胞增殖、分化、凋亡等，也能調控下游的NF?κB等，是研究潰瘍性結腸炎、炎?癌轉變過程、結直腸癌的經典信號通路，對于疾病的治療具有重要作用，但在各種生理以及病理過程中細胞內其他信號通路與其交互整合過程依然不夠清楚，如在中藥單體對結直腸癌的研究中，同樣的腫瘤細胞系得到的實驗結論不一致，可能是因為對通路的檢測指標較為局限，對信號通路上下游因子的變化沒有進行深入的系統的分析研究。因此在對信號通路作用機制的研究，特別是中醫藥對疾病影響下的機體調控網絡作用的探討，需要更進一步更全面的研究。

4.2 復方在腫瘤中的研究較少 中醫認為人體是一整體，中藥以及復方是多組分多靶點的，對疾病的調控通過復雜的網絡調控機制來發揮作用，包括介導多種信號通路如MAPK 通路、NF?κB 通路、STATs 通路等，但中醫藥特別是經方對于疾病的作用機制尚未完全闡明。而在中醫藥通過介導MAPK 通路對腫瘤的調控研究中，對中藥單體研究較多，以中藥復方作為研究對象的則相對較少。因此，需要加強中藥復方在MAPK 信號轉導通路中的研究，如借助網絡藥理研究的方法和手段理清中藥復方多靶點、多渠道影響信號通路的網絡圖。中藥復方的多樣作用對應了信號通路調控的復雜性，而這正是其發揮作用的特色和優勢，闡明作用機制有助于進一步開發中藥新產品，擴大臨床應用。

4.3 炎?癌轉化領域研究較少 潰瘍性結腸炎患者癌變隨病程的延長而升高，所以炎?癌轉化的病理機制與治療藥物的研發也是科研熱點之一。目前中醫藥也有炎?癌轉化的研究，如芍藥湯、黃芩湯對AOM／DSS 造模小鼠的干預研究等，但信號轉導通路中MAPK 通路研究較少，多為Wnt／β?catenin、STATs 信號通路，針對這種情況，需要擴大中醫藥在炎?癌轉化領域的研究，臨床和基礎研究相結合，闡明臨床有效方劑的多重分子機制。

綜上所述，中醫藥對炎癥、炎?癌轉化及癌癥等具有良好的臨床預防和治療作用，但中藥篩選不夠全面，對其分子機制信號通路的研究也較為單一，未從整體進行系統研究。中藥影響MAPK 通路的機理還需深入研究，為抗炎抗腫瘤新藥的研發提供基礎研究支撐。