三葉青地上部分提取物對(duì)H22 荷瘤小鼠的抗轉(zhuǎn)移作用

王碧旭 盧靜靜孫棱程雯 周芳美 朱炳祺 丁志山?

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與信息工程學(xué)院， 浙江 杭州310053； 2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州310053）

肝癌作為全球最常見(jiàn)的的十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率常年位居前列，全球約59%的新發(fā)病例分布于我國(guó)各地［1］。肝癌具有異質(zhì)性強(qiáng)、潛伏期長(zhǎng)、預(yù)后差等特點(diǎn)，大部分患者均于晚期被確診且發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，致其迅速死亡［2?3］。目前，肝移植、肝切除及血管介入等為常規(guī)治療方法，但易致患者預(yù)后不良［4?6］。中藥可通過(guò)多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用，且毒副作用較小。三葉青Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg 為我國(guó)特有的葡萄科崖爬藤屬珍稀藥用植物，其全草均可入藥，具有抗腫瘤、保肝護(hù)肺、調(diào)節(jié)免疫等藥理作用［7?10］，于2018 年被列為新“浙八味”。本研究旨在探討三葉青地上部分抗肝癌作用，篩選出其抗腫瘤主要藥效成分，以期為三葉青的進(jìn)一步深入開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB／c 雄性小鼠100只，體質(zhì)量20～24 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2017?0005。

1.2 細(xì)胞株 小鼠肝癌H22 細(xì)胞株由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.3 試劑與藥物 三葉青地上部分均采自浙江省杭州市富陽(yáng)區(qū)，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)丁志山教授鑒定為正品。注射用環(huán)磷酰胺（德國(guó) Baxter Oncology GmbH 公司，批 號(hào)7J196G）；TNF?α 試劑盒、IL?6 試劑盒、IFN?γ 試劑盒（上海信帆生物科技有限公司，批號(hào) 20160627158、20160612056、20160302016）；IL?2 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)MM?43631M1）。其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 凍干機(jī)（美國(guó)Labconco 公司，型號(hào)FreeZone 4.5）；體式顯微鏡（日本尼康公司，型號(hào)SMZ25）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher 公司，型號(hào)Series ⅡWater Jacket）；微孔板酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司，型號(hào)Epoch2）。

2 方法

2.1 三葉青地上部分提取物的制備

2.1.1 三葉青地上部分醇提物 取適量干燥的三葉青地上部分打粉，過(guò)60 目篩，按料液比1∶15，加入95%乙醇冷凝回流2次，每次1.5 h，合并2 次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇味，制得醇提物，備用，收集濾渣。

2.1.2 三葉青地上部分多糖 取“2.1.1”項(xiàng)下濾渣按照料液比1∶15 加入雙蒸水，冷凝回流提取2次，每次1.5 h，減壓過(guò)濾，合并2 次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，采用Sevag法去除蛋白部分，重復(fù)2次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)試劑，減壓濃縮，緩慢加入3 倍體積95% 乙醇，充分混勻，靜置12 h，4 000 r／min離心10 min，收集沉淀，用無(wú)水乙醇反復(fù)洗脫沉淀2次，抽濾去除乙醇，將沉淀真空冷凍干燥后制得粗多糖組分，備用。

2.2 H22 荷瘤小鼠模型的建立 H22 細(xì)胞按常規(guī)方法培養(yǎng)后，取健康小鼠腹腔注射肝癌細(xì)胞懸液0.2 mL，1 周后小鼠腹部膨隆，無(wú)菌條件下抽取小鼠腹水，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)離心洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108／mL，取0.05 mL 瘤細(xì)胞懸液接種于除空白組外其余小鼠左后肢爪墊內(nèi)側(cè)皮下。

2.3 分組及給藥 將小鼠隨機(jī)分為空白組，模型組，玉米油組，環(huán)磷酰胺組（40 mg／kg），醇提物低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組10 只。環(huán)磷酰胺組作為陽(yáng)性對(duì)照組，玉米油組作為陰性對(duì)照組；醇提物各劑量組小鼠灌胃給予用玉米油溶解的三葉青地上部分醇提物；多糖各劑量組小鼠灌胃給予用無(wú)菌生理鹽水溶解的三葉青地上部分多糖；環(huán)磷酰胺組小鼠隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺；空白組、模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水；玉米油組小鼠灌胃給予等體積玉米油，每天1次，連續(xù)給藥21 d。

2.4 小鼠抑瘤率和臟器指數(shù)檢測(cè) 各組小鼠末次給藥后禁食24 h，脫頸處死，剝離瘤塊、脾臟、胸腺、肝臟組織，稱定質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)，公式為抑瘤率＝［（模型組平均瘤質(zhì)量－給藥組平均瘤質(zhì)量）／模型組平均瘤質(zhì)量］ ×100%，臟器指數(shù)＝臟器平均質(zhì)量／體質(zhì)量×100%。

2.5 小鼠腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶檢測(cè) 剝離各組小鼠肺組織、右側(cè)腘窩、髂動(dòng)脈旁、腎門處的淋巴結(jié)，用Bouin 液固定，48 h 后在體式顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶，并記錄轉(zhuǎn)移灶數(shù)。

2.6 ELISA 法檢測(cè)小鼠血清TNF?α、IL?6、IL?2、IFN?γ 水平 各組小鼠末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血并處死，收集血液，3 000 r／min 離心10 min，分離得血清，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)小鼠血清TNF?α、IL?6、IL?2、IFN?γ 水平。

2.7 HE 染色觀察小鼠腫瘤組織病理學(xué)變化 取各組小鼠剝離的瘤塊于4%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠腫瘤組織病理學(xué)改變。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 17.0 軟件、Graphpad Prism 5.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響 與模型組、玉米油組比較，醇提物低劑量組小鼠瘤質(zhì)量、瘤體積降低（P＜0.05），多糖各劑量組小鼠瘤質(zhì)量、瘤體積降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈劑量依賴性，見(jiàn)表1、圖1。

圖1 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（，n＝10）

表1 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響（n ＝10）

3.2 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 與空白組比較，模型組小鼠脾臟、肝臟指數(shù)升高（P＜0.05），胸腺指數(shù)無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與模型組比較，玉米油組小鼠脾臟指數(shù)降低（P＜0.05），多糖各劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.05），肝臟指數(shù)降低（P＜0.05），環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與玉米油組比較，醇提物各劑量組小鼠各臟器指數(shù)均無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與環(huán)磷酰胺組比較，多糖各劑量組和醇提物各劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10）

3.3 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的影響 小鼠經(jīng)21 d 生長(zhǎng)后，模型組小鼠腫瘤遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移、淋巴道轉(zhuǎn)移情況嚴(yán)重，肺表面與淋巴結(jié)表面均出現(xiàn)不同級(jí)別的圓形小突起轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組和多糖各劑量組小鼠肺、淋巴道轉(zhuǎn)移灶數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01）；與玉米油組比較，醇提物低、中劑量組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)減少（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn) 圖3～4。

圖3 各組小鼠遠(yuǎn)端肺（A，×6.3）、淋巴道（B，×12.6）轉(zhuǎn)移圖

圖4 三葉青地上部分提取物對(duì)H22 荷瘤小鼠腫瘤遠(yuǎn)端肺、淋巴道轉(zhuǎn)移的影響（，n＝10）

3.4 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平的影響 與空白組比較，模型組、玉米油組小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，多糖低劑量組小鼠血清IL?2 水平升高（P＜0.05），多糖中劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6 水平升高（P＜0.05，P＜0.01），多糖高劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平升高（P＜0.01），環(huán)磷酰胺組小鼠血清TNF?α、IFN?γ 水平升高（P＜0.05）；與玉米油組比較，醇提物低劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2 水平升高（P＜0.05）；與環(huán)磷酰胺組比較，多糖低劑量組小鼠血清IL?6 水平升高（P＜0.05），多糖中劑量組小鼠血清IL?2、IL?6 水平升高（P＜0.01），多糖高劑量組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ水平升高（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)圖5。

圖5 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平的影響（，n＝10）

3.5 三葉青地上部分提取物對(duì)小鼠腫瘤組織病理學(xué)的影響 模型組、玉米油組小鼠H22 腫瘤細(xì)胞排列紊亂、大小不一，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，生長(zhǎng)旺盛且部分細(xì)胞呈侵襲性生長(zhǎng)；環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤組織內(nèi)部細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制且呈不規(guī)則變形，細(xì)胞數(shù)明顯減少；多糖各劑量組和醇提物各劑量組小鼠腫瘤細(xì)胞排列疏松，可見(jiàn)一定的細(xì)胞碎片和腫瘤細(xì)胞壞死區(qū)域，特別是多糖組腫瘤細(xì)胞壞死現(xiàn)象更為明顯，見(jiàn)圖6。

圖6 各組小鼠腫瘤組織病理HE 染色圖（×200）

4 討論

肝癌具有轉(zhuǎn)移速度快、惡性程度高、預(yù)后不良等特點(diǎn)，是我國(guó)腫瘤致死的第二大“元兇”［11?12］。迄今為止，放化療聯(lián)合應(yīng)用仍然是治療肝癌最常用的方法，但其易導(dǎo)致患者機(jī)體乏力、骨髓抑制及局部皮膚損傷，亦能損傷機(jī)體免疫功能。三葉青作為臨床常用抗腫瘤藥物，含有多種藥用活性成分，前期對(duì)三葉青的研究多圍繞塊根及其醇提物類化合物抗腫瘤作用展開［13?15］，鮮有關(guān)于三葉青地上部分藥理作用的研究。然而，臨床上三葉青地上部分和塊根同樣使用，用藥方式為水煎服，水溶性成分中含量最高的為多糖，因此推測(cè)多糖是三葉青重要的藥效物質(zhì)。

本研究通過(guò)建立H22 荷瘤小鼠模型，旨在探究三葉青地上部分各組分抗轉(zhuǎn)移作用。在小鼠整個(gè)腫瘤生長(zhǎng)周期，多糖各劑量組小鼠腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，最高抑瘤率可達(dá)43.07%。郭菁菁等［16］研究發(fā)現(xiàn)，三葉青多糖可有效減少乳腺癌小鼠遠(yuǎn)端肺轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移性，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，多糖各劑量組H22 荷瘤小鼠腫瘤遠(yuǎn)端肺和淋巴道轉(zhuǎn)移均得到抑制，提示三葉青地上部分多糖可有效抑制腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。環(huán)磷酰胺作為臨床廣泛使用的一種抗腫瘤藥物，藥效顯著，但極易導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降。與模型組比較，環(huán)磷酰胺組小鼠胸腺指數(shù)降低，而多糖各劑量組小鼠胸腺指數(shù)升高，提示多糖對(duì)免疫器官具有一定的保護(hù)作用。同時(shí)，腫瘤組織病理學(xué)結(jié)果顯示，三葉青地上部分多糖可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死。

細(xì)胞因子在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中至關(guān)重要，TNF?α、白細(xì)胞介素、IFN?γ 均能激活機(jī)體免疫應(yīng)答，在抗腫瘤方面承擔(dān)著重要角色［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清TNF?α、IL?2、IFN?γ 水平低于空白組（P＜0.05）；而多糖組小鼠血清TNF?α、IL?2、IL?6、IFN?γ 水平高于模型組（P＜0.05，P＜0.01），說(shuō)明三葉青地上部分多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體相關(guān)細(xì)胞因子水平而增強(qiáng)免疫功能。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)三葉青地上部分多糖具有良好的抗轉(zhuǎn)移作用，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答、抑制腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死而發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗轉(zhuǎn)移的作用。本研究初步證實(shí)三葉青地上部分具有與三葉青地下部分相同的抗腫瘤作用，為三葉青資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，對(duì)三葉青的臨床應(yīng)用與治療具有一定的指導(dǎo)意義。