加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠氧化應(yīng)激、能量代謝及免疫平衡的影響

崔 璀 張振巍

（1.河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院， 河南 開封450000； 2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院， 河南開封475000）

根據(jù)中醫(yī)的“八綱辨證”理論，慢性萎縮性胃炎屬于“胃脘痛”“胃痞”范疇，其中醫(yī)證型分布基本認(rèn)同病位在胃，并存脾胃、腎功能失調(diào)，其中脾胃濕熱證為臨床常見的證型，主要臨床表現(xiàn)為胃脘疼痛，舌苔黃厚、膩，口苦、臭，舌質(zhì)紅，惡心，嘔吐，大便粘滯或稀溏，脈數(shù)滑。現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)，胃腸道功能紊亂與胃腸水液代謝機(jī)制失調(diào)有密切關(guān)系，而水通道蛋白（AQPs）是一類介導(dǎo)水分子快速轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白，在哺乳動物的消化系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，目前已發(fā)現(xiàn)的13 種AQP中，AQP1、AQP3、AQP4、AQP8、AQP9 等在遠(yuǎn)端小腸和近端結(jié)腸中高度表達(dá)［1］，提示AQPs 的分布與胃腸道水液代謝有密切關(guān)系。臨床研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)胃腸道疾病的發(fā)病本質(zhì)均為胃腸道水液代謝紊亂，而AQPs 在胃腸道疾病中的表達(dá)程度與疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有密切聯(lián)系［2?3］。加味三仁湯為祛濕方劑，在三仁湯基礎(chǔ)上增加黃芩、黃連、半夏、茯苓等中藥，具有宣暢氣機(jī)、清熱利濕之功效，本研究從多角度的調(diào)節(jié)因子入手，考察加味三仁湯對脾胃濕熱動物模型能量代謝、水液代謝、炎癥因子、免疫調(diào)節(jié)因子、氧化細(xì)胞因子等的干預(yù)作用，揭示加味三仁湯對胃腸道水液代謝、能量代謝紊亂的調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SPF 級SD 大鼠50只，清潔級，體質(zhì)量180～220 g，購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK（豫）2013?0002。

1.2 試劑 AQP4 ELISA 試劑盒購自武漢中美科技有限公司；分泌型免疫球蛋白A（sIgA）試劑盒購自河南博瑞醫(yī)療器械有限公司；腫瘤壞死因子（TNF?α）、白細(xì)胞介素10（IL?10）、γ?干擾素（IFN?γ）、白細(xì)胞介素2（IL?2）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）、H＋?K＋?ATP 酶活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。56°紅星二鍋頭，購自北京紅星股份有限公司。

2 方法

2.1 加味三仁湯煎液的制備 加味三仁湯為中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院院內(nèi)制劑，所有中藥飲片均經(jīng)過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九八八醫(yī)院藥劑科張振巍副主任藥師鑒定為正品，放置陰涼干燥處備用。參考《溫病條辨》處方組成，加10 倍量水浸泡30 min，煎煮提取2次，每次1.5 h，合并煎液，減壓濃縮至50 mL，藥物質(zhì)量濃度為1.8 g／mL，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案稀釋成相應(yīng)的藥物質(zhì)量濃度，即0.45、0.9、1.8 g／mL，置于4 ℃冷藏備用。按照《中藥藥理研究方法學(xué)》中人與大鼠的劑量換算公式計(jì)算給藥劑量，得出大鼠每天給藥劑量為9.45 g／kg，設(shè)定高、中、

低給藥劑量分別為18.9、9.45、4.725 g／kg，連續(xù)給藥4 周。

2.2 分組與建模 將50 只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，加味三仁湯低、中、高劑量組，每組10只。參考文獻(xiàn)［4］ 報(bào)道，除正常組外，其余各組大鼠建立脾胃濕熱模型，在造模前禁食12 h，自由飲水，正常組大鼠采用普通飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度20～28 ℃，相對濕度為50%～60%。脾胃濕熱動物模型采用綜合因素復(fù)制法，即采用“內(nèi)濕＋外濕＋生物致病因子”的綜合因素復(fù)制脾胃濕熱大鼠模型。高脂高糖飼料（普通飼料＋12%豬油＋8%蜂蜜）連續(xù)喂養(yǎng)10 d，第11 天在原來喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上將大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境改為人工氣候箱，在（33±2）℃、相對濕度95% 下飼養(yǎng)，每天上午3 h，下午3 h，并于固定時(shí)間灌胃給予紅星二鍋頭10 mL／kg，連續(xù)8 d；第19 天灌胃給予大腸桿菌10 mL／kg，24 h 后加強(qiáng)感染1次，劑量為5 mL／kg，移出置于自然環(huán)境，第20 天各組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，加味三仁湯各劑量組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)給藥14 d，觀察各組大鼠一般狀態(tài)及體征。

2.3 ELISA 法檢測結(jié)腸黏膜組織sIgA、AQP4 水平及血漿炎癥因子、氧化應(yīng)激因子水平 大鼠處死前，禁食12 h，麻醉后經(jīng)腹主動脈取血于抗凝管內(nèi)，3 000 r／min 離心10 min，分離得血漿，置于－20 ℃冷凍保存；各組大鼠脫臼處死后，迅速解剖，取大約距離肛門4 cm 處的結(jié)腸部位，PBS 沖洗，冰浴中用生理鹽水將結(jié)腸部位進(jìn)行沖洗，刮取結(jié)腸內(nèi)膜組織，于PBS 中進(jìn)行組織勻漿，勻漿液置于－20 ℃過夜備用。嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作，檢測大鼠結(jié)腸黏膜組織勻漿液中sIgA、AQP4 水平，血漿TNF?α、IL?10、IFN?γ、IL?2、MDA 水平和SOD、GSH?Px活性。

2.4 能量代謝指標(biāo)ATP 酶活性檢測 撥片刮取各組大鼠胃黏膜并稱定質(zhì)量，加入49 倍量生理鹽水，研磨制成質(zhì)量濃度為20 g／L 的胃黏膜勻漿液，3 000 r／min 離心10 min，取上清液，加入H＋?K＋?ATP 酶激活劑，45 ℃水浴5 min，采用紫外分光光度計(jì)檢測勻漿液中蛋白總量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài)及體征 正常組大鼠動作靈活，皮毛潔白光潔，大便成形；模型組大鼠體溫升高，倦怠，反應(yīng)遲鈍，毛發(fā)槁枯，大便溏泄，肛周污穢較多，提示脾胃濕熱證大鼠模型復(fù)制成功。

3.2 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠結(jié)腸黏膜組織sIgA、AQP4 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織AQP4 水平升高（P＜0.05），sIgA 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，加味三仁湯各劑量組大鼠結(jié)腸黏膜組織AQP4 水平均降低（P＜0.05），sIgA 水平均升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表1。

表1 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠結(jié)腸黏膜組織sIgA、AQP4 水平的影響（，n＝10）

表1 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠結(jié)腸黏膜組織sIgA、AQP4 水平的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與加味三仁湯低劑量組比較，△P＜0.05；與加味三仁湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

3.3 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠外周血TNF?α、IL?10、IFN?γ、IL?2 水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠外周血TNF?α、IFN?γ、IL?2 水平升高（P＜0.05），IL?10 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，加味三仁湯各劑量組大鼠外周血TNF?α、IFN?γ、IL?2 水平降低（P＜0.05），IL?10 水平升高（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表2。

表2 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠外周血TNF?α、IL?10、IFN?γ、IL?2 水平的影響（，n＝10）

表2 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠外周血TNF?α、IL?10、IFN?γ、IL?2 水平的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與加味三仁湯低劑量組比較，△P＜0.05；與加味三仁湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

3.4 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠血漿MDA 水平和SOD、GSH?Px 活性的影響 與正常組比較，模型組大鼠血漿SOD、GSH?Px 活性降低（P＜0.05），MDA 水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味三仁湯各劑量組大鼠SOD、GSH?Px 活性升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表3。

表3 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠血漿MDA 水平和SOD、GSH?Px 活性的影響（，n＝10）

表3 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠血漿MDA 水平和SOD、GSH?Px 活性的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與加味三仁湯低劑量組比較，△P＜0.05；與加味三仁湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

3.5 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠能量代謝指標(biāo)的影響與正常組比較，模型組大鼠胃黏膜和骨骼肌能量代謝水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，加味三仁湯各劑量組大鼠胃黏膜和骨骼肌能量代謝水平降低（P＜0.05），并呈劑量依賴性，見表4。

表4 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠能量代謝指標(biāo)的影響（U／mgprot，，n＝10）

表4 加味三仁湯對脾胃濕熱證大鼠能量代謝指標(biāo)的影響（U／mgprot，，n＝10）

注：與正常組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與加味三仁湯低劑量組比較，△P＜0.05；與加味三仁湯中劑量組比較，▲P＜0.05。

4 討論

脾胃濕熱證患者臨床表現(xiàn)主要是消化、吸收、營養(yǎng)障礙等為主要證候的一系列病證［5］，脾胃濕熱患者機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收，精微物質(zhì)的傳輸，氣血津液的轉(zhuǎn)化等一系列生命過程都將受到不同程度的影響，基于此，本研究從能量代謝、水液代謝、炎癥因子等角度來評價(jià)加味三仁湯對脾胃濕熱證的治療效果，以期為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)［6?7］。

分泌型免疫球蛋白A（sIgA）的水平?jīng)Q定了黏膜相關(guān)淋巴組織免疫能力的強(qiáng)弱［8?9］。IL?2 主要效應(yīng)功能是增強(qiáng)吞噬細(xì)胞的抗感染機(jī)制，對機(jī)體的細(xì)胞免疫功能發(fā)揮監(jiān)視作用［10］。IL?10 最主要的生理學(xué)作用就是限制和終止炎癥反應(yīng)，抑 制IFN?γ、TNF?α 等促炎因子表 達(dá)［11?12］。SOD 和GSH?Px 是機(jī)體的抗氧化酶，MDA 是氧化應(yīng)激中間產(chǎn)物，三者的動態(tài)平衡反應(yīng)機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度［13?14］。脾胃的能量代謝主要體現(xiàn)在ATP 酶活性的釋放，ATP 酶的活性可以反應(yīng)出機(jī)體能量代謝水平，該過程符合中醫(yī)“脾主肌肉”的辯證理論［15?16］。

本研究顯示，采用多因素綜合模式復(fù)制脾胃濕熱證大鼠模型，大鼠的體征表現(xiàn)與臨床癥狀具有相似性，提示模型復(fù)制成功，該結(jié)果與各免疫因子及炎癥因子水平趨勢一致，進(jìn)一步證實(shí)模型復(fù)制成功。脾胃濕熱證大鼠AQP4 水平升高，導(dǎo)致腸道水液代謝的紊亂，進(jìn)而引起大鼠腸道水分吸收、排泄失調(diào)；加味三仁湯對AQP4 水平具有調(diào)節(jié)作用，并呈現(xiàn)劑量依賴性，提示加味三仁湯可能通過降低AQP4 水平來調(diào)節(jié)腸道水液代謝平衡。脾胃濕熱證大鼠的ATP 酶活性強(qiáng)于正常組，這是由于機(jī)體對濕熱致病因素和各種內(nèi)源性調(diào)節(jié)因素作出的一種代謝性效應(yīng)，酶活性的提高必然會增加細(xì)胞內(nèi)ATP 的消耗，脾胃濕熱證基礎(chǔ)酶活性和基礎(chǔ)能量代謝呈現(xiàn)代償性增高；加味三仁湯能調(diào)節(jié)脾胃濕熱證大鼠的能量代謝平衡，降低細(xì)胞內(nèi)ATP 的消耗。

綜上所述，加味三仁湯可促進(jìn)結(jié)腸黏膜組織的修復(fù)，升高sIgA 水平，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)結(jié)腸黏膜的機(jī)械屏障和免疫屏障的目的；同時(shí)加味三仁湯還能通過降低AQP4 水平來調(diào)整腸道水液代謝；升高抗炎因子IL?10 水平，降低炎癥因子TNF?α、IFN?γ、IL?2 水平，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激因子水平來平衡機(jī)體免疫，降低炎癥反應(yīng)；通過調(diào)節(jié)能量代謝減輕機(jī)體能量的過度消耗進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療目的。