蒲公英總黃酮對CCl4 致大鼠肝損傷的保護作用

朱正望 付雙楠薛寧 馬瑞雪 郭桓博 苗明三 朱平生

（河南中醫(yī)藥大學， 河南 鄭州450046）

肝臟是人體重要的解毒和代謝器官，多種因素如病毒感染、藥物濫用、有毒化學物質、過度飲酒等都會引起肝功能異常導致肝損傷，是肝硬化、肝癌等眾多肝臟疾病的重要始動因素，重者可進一步發(fā)展為急性肝衰竭［1?2］。針對肝損傷的早發(fā)現(xiàn)、早干預對避免其進展為重型肝病和保障大眾健康具有十分重要的意義。臨床上對于肝損傷的治療多采用維生素類、核苷類似物、保肝降酶藥等對癥治療，對改善患者的癥狀雖有一定的療效，但也會加重肝臟的負擔［3?4］。因此，探索更安全高效、早期干預的藥物對于臨床肝病的防治具有重要意義。

中醫(yī)藥對于肝病的防治療效顯著，近年來在肝病的基礎實驗和臨床研究方面已成為主要的熱點［5?6］。蒲公英是一種應用十分廣泛的藥食同源中藥，性寒，味苦、甘，歸肝、胃經，具有清熱解毒、利尿消腫的作用［7］。黃酮類是蒲公英的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、保肝利膽、增強免疫力等多種藥理活性，應用價值大［8?9］。眾多研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分在抗肝損傷方面效果顯著，具有廣闊的開發(fā)前景和研究空間［10?11］。前期研究發(fā)現(xiàn)，Arg1、α?GST、PNP、GLDH 作為CCl4致大鼠肝損傷早期生物標志物，較傳統(tǒng)肝功能檢測指標具有較好的靈敏性［12］。本研究在此基礎上檢測CCl4肝損傷大鼠傳統(tǒng)肝功能指標、脂質過氧化指標、早期生物標志物，觀察蒲公英總黃酮對CCl4肝損傷早期的干預作用。

1 材料

1.1 儀器 Multiskan Fc 型酶標儀、YZB5065?2011 型洗板機（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；KDC?160HR 型高速冷凍離心機（合肥科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；UV?2000 型紫外可見分光光度計［尤尼柯（上海）儀器有限公司］；BX63 型電動顯微鏡（日本Olympus 公司）；ABI7500 型熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 試劑與藥物 蒲公英總黃酮（含量＞50%，批號20160505，西安澳瑞特生物科技有限公司）。聯(lián)苯雙酯（批號A020141206，臺州萬邦德制藥集團股份有限公司）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽紅素（TBIL）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、還原型谷胱甘肽（GSH）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號20160809、20160808、20160812、20160730、20160810、20160810、20160810，南京建成生物工程研究所）；精氨酸酶?1（Arg?1）、α?谷胱甘肽?S?轉移酶（α?GST）、嘌呤核苷酸磷酸化酶（PNP）、谷氨酸脫氫酶（GLDH）ELISA 試劑盒（批號均為20160810，蘇州卡爾文生物科技有限公司）；TRIzol 總RNA 提取試劑盒［批號DP405?02，天根生化科技（北京）有限公司］；CCl4（批號20160302，天津市富宇精細化工有限公司）。

1.3 動物 Wistar 大鼠，SPF級，體質量180～220 g，雌雄各半，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（魯）2014?0007，實驗動物使用許可證號SYXK（豫）2015?0005。研究經河南中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準（批準號DWLL16010005）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 144 只大鼠隨機分為空白組，模型組，聯(lián)苯雙酯組（3.75 mg／kg），蒲公英總黃酮低、中、高劑量組（50、100、200 mg／kg），每組24只，給藥組分別按相應劑量灌胃給予聯(lián)苯雙酯或蒲公英總黃酮混懸液，空白組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，給藥容量10 mL／kg，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，空白組大鼠腹腔注射橄欖油溶液10 mL／kg，其余各組大鼠腹腔注射10% CCl4橄欖油溶液10 mL／kg 進行造模［13］。

2.2 樣本采集與指標檢測 于造模后3、6、12、24 h 取各組大鼠6只，腹腔注射10% 水合氯醛（3 mL／kg）進行麻醉，腹主動脈取血，3 500 r／min 離心10 min，分離血清，取肝右葉加預冷生理鹽水制成10%組織勻漿，3 500 r／min離心10 min，取上清液；取肝左葉于4%甲醛溶液中固定，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。采用微板法檢測血清ALT、AST、ALP、TBIL 水平及肝組織SOD 活性、GSH水平，比色法檢測肝組織MDA 水平，ELISA 法檢測血清Arg?1、α?GST、PNP、GLDH 水平，RT?qPCR 法檢測血清及肝組織中miR?122 mRNA 表達。

2.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 21.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示，各組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALT、AST 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清ALT 水平在3、12、24 h，蒲公英總黃酮低、中劑量組在3、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01），蒲公英總黃酮高劑量組無明顯變化（P＞0.05）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠血清AST 水平在3、6、12 h 降低（P＜0.05，P＜0.01），蒲公英總黃酮中、高劑量組無明顯變化（P＞0.05），見表1。

表1 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALT、AST 水平的影響（，n＝6）

表1 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALT、AST 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清ALP、TBIL 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠血清ALP 水平在3、6、12、24 h，蒲公英總黃酮中劑量組在6、12、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組在12、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮低、中劑量組大鼠血清TBIL 水平在12 h 降低（P＜0.05），蒲公英總黃酮高劑量組無明顯變化（P＞0.05），見表2。

表2 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響（，n＝6）

表2 蒲公英總黃酮對大鼠血清ALP、TBIL 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 蒲公英總黃酮對大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠肝組織MDA 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01），SOD 活性降低（P＜0.05，P＜0.01），GSH 水平在6、12、24 h 均降低（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠肝組織SOD活性在24 h 升高（P＜0.05），蒲公英總黃酮各劑量組無明顯變化（P＞0.05）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮低劑量組大鼠肝組織GSH 水平在6、12、24 h，蒲公英總黃酮中劑量組在6、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組在24 h 升高（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮低、中劑量組大鼠肝組織MDA 水平在3、6、12、24 h，蒲公英總黃酮高劑量組 在6、12、24 h降低（P＜0.05，P＜0.01），見表3。

表3 蒲公英總黃酮對大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH 水平的影響（，n＝6）

表3 蒲公英總黃酮對大鼠肝組織SOD 活性及MDA、GSH 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 蒲公英總黃酮對大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清Arg?1、α?GST 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清Arg?1 水平在3 h，蒲公英總黃酮低、高劑量組在3、12 h，蒲公英總黃酮中劑量組在3、12、24 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組及蒲公英總黃酮中、高劑量組大鼠血清α?GST 水平無明顯變化（P＞0.05），蒲公英總黃酮低劑量組α?GST 水平在3 h 降低（P＜0.01），見表4。

表4 蒲公英總黃酮對大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響（，n＝6）

表4 蒲公英總黃酮對大鼠血清Arg?1、α?GST 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 蒲公英總黃酮對大鼠血清PNP、GLDH 水平的影響與空白組比較，模型組大鼠血清PNP、GLDH 水平在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組大鼠血清PNP 水平在3、6、12 h，蒲公英總黃酮低劑量組在12 h，蒲公英總黃酮中劑量組在3、6 h，蒲公英總黃酮高劑量組在6 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組大鼠血清GLDH 水平在3 h，蒲公英總黃酮各劑量組在3、12 h 降低（P＜0.01），見表5。

表5 蒲公英總黃酮對大鼠血清PNP、GLDH 水平的影響（，n＝6）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 蒲公英總黃酮對大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達的影響 與空白組比較，模型組大鼠血清miR?122 mRNA表達在3、6、12、24 h 均升高（P＜0.01），肝組織miR?122 mRNA 表達在6、24 h 升高（P＜0.05）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮中劑量組大鼠血清miR?122 mRNA表達無明顯變化（P＞0.05），蒲公英總黃酮低、高劑量組在6、12 h 降低（P＜0.05，P＜0.01）；聯(lián)苯雙酯組、蒲公英總黃酮高劑量組大鼠肝組織miR?122 mRNA 表達在24 h 降低（P＜0.05），蒲公英總黃酮低、中劑量組無明顯變化（P＞0.05），見表6。

表6 蒲公英總黃酮對大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達的影響（，n＝3）

表6 蒲公英總黃酮對大鼠血清及肝組織miR?122 mRNA 表達的影響（，n＝3）

注：與空白組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.7 蒲公英總黃酮對大鼠肝組織病理變化的影響 空白組大鼠肝小葉結構清晰，肝索排列有序，肝細胞未見異常；模型組大鼠肝小葉結構消失，肝索排列紊亂，多數(shù)肝細胞腫脹、壞死，可見大量的肝細胞脂肪變性，并有明顯的炎細胞浸潤現(xiàn)象，且隨造模時間的增加，損傷逐漸加重；聯(lián)苯雙酯組大鼠肝細胞偶見點狀壞死，匯管區(qū)有少量炎細胞浸潤，腫脹不明顯；蒲公英總黃酮各劑量組大鼠肝細胞病變程度較輕，肝細胞腫脹及脂肪變性較少，肝細胞壞死程度明顯減輕，部分胞漿內可見小的脂滴形成，見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織HE 染色（×200）

4 討論

CCl4作為典型的化學性肝毒性物質，其誘導的大鼠肝損傷表現(xiàn)及進程與人類肝損傷病理變化相似，因此被廣泛用于肝損傷大鼠模型的研究以及保肝藥物的篩選［14?15］。CCl4通過腹腔注射進入肝臟，經肝微粒體細胞色素P450 代謝酶系統(tǒng)，產生三氯甲基等毒性物質，可結合細胞膜上的磷脂分子，引發(fā)脂質過氧化反應，破壞肝組織細胞膜結構，使細胞膜的通透性增加［16?17］。

肝組織受到損傷時，肝細胞內各種酶如ALT、AST 會大量釋放到血液中，因此，血清中轉氨酶升高是肝損傷的重要指標，在一定程度上反映了肝細胞受損程度［18］。肝損傷導致體內ALP、TBIL 排泄障礙而反流入血，從而引起血清ALP、TBIL 水平增高，其主要反映肝臟受損時黃疸和膽汁淤積的程度［19?20］。在脂質過氧化反應過程中，機體產生大量的MDA，持續(xù)破壞肝細胞膜結構，加劇肝臟受損程度，使肝細胞發(fā)生變性甚至壞死，從而加重病變［21］。SOD、GSH 是機體重要的內源性抗氧化酶，能有效清除體內過量的自由基并增強機體的抗氧化能力，保護肝細胞結構和功能的完整［22?23］。本研究顯示，蒲公英總黃酮預防性干預后，降低了大鼠血清中AST、ALT、TBIL、ALP 水平，減少肝組織中MDA 水平，提高SOD 活性和GSH 水平，各給藥組大鼠肝細胞病變程度減輕，肝細胞腫脹及脂肪變性較少，說明蒲公英總黃酮可以減輕體內氧化應激損傷，穩(wěn)定肝細胞結構，減少炎細胞浸潤從而減輕肝臟損傷的程度。

PNP 主要位于肝細胞等的細胞質中，正常情況下多數(shù)檢測不到，只有當肝細胞受到損傷時，才會在血液中被檢測到，其敏銳度高于傳統(tǒng)的肝損傷指標，可以作為潛在的肝細胞損傷的標志物［24］；Arg?1 是肝臟中重要的水解酶，多分布于肝細胞核、微粒體，能夠催化精氨酸生成尿素和鳥氨酸，研究表明其在肝損傷中有較高的靈敏度［25］；GLDH 在肝臟中水平最高，肝損傷時線粒體膜受到破壞，血液中的GLDH 升高，其對于肝損傷的診斷具有較高的敏感性［26］；α?GST 多分布在肝小葉中心細胞，在肝損傷早期就會透過受損的細胞膜進入血液，是理想的早期肝損傷指標［27］；miR?122 是在肝細胞中特異性高表達的miRNA，對于維持肝臟的正常代謝功能有重要的調控作用，在肝損傷早期血液中就可以檢測到其表達顯著升高，較傳統(tǒng)的肝功能檢測指標更靈敏［28?29］。本研究顯示，蒲公英總黃酮各劑量組可以不同程度降低大鼠血清中PNP、Arg?1、GLDH、α?GST 水平和miR?122 表達，但對于相關指標的改善作用量效關系不明顯，初步表明蒲公英總黃酮在CCl4致大鼠肝損傷早期即可起到一定的預防和保護作用，后期仍有待進行進一步的深入研究。