梭果黃芪、云南黃芪對血栓形成的影響

付 姿 郭羽 伍蓉霜王金達沈磊?

［1.大理大學藥物研究所， 云南 大理671000； 2.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點實驗室（培育）， 云南 大理671000； 3.大理大學藥學院， 云南 大理671000］

血栓是高致死性缺血性心血管病的元兇，而目前用于防止血栓性疾病的藥物均有增加出血風險、作用靶點單一導致耐受性等缺點［1］，尋找出血副作用少的多靶點抗血栓藥物仍有必要。理氣活血的中藥被廣泛應用于血栓性疾病（即血瘀證）的治療，具有高效低毒和多靶點抗血栓的優點［2］。中藥黃芪以補氣虛為主，有治療血瘀證的理論基礎，并在多個研究中顯示出一定的抗血栓活性，如抑制膠原蛋白?腎上腺素誘導的體內血栓和體外血栓形成［3］，減少靜脈血栓形成［4］，抑制血小板聚集［5］等。同時，黃芪也是抗血小板組方中的重要成分之一［6］。

正品黃芪包括膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.和蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao，主要生長于東北、華北和西北的高緯度地區。云南無正品黃芪分布，但是由于環境的多樣性，有很多黃芪屬植物分布。絕大部分云南黃芪屬植物生長于滇西北的高海拔地區，屬于特殊生態環境植物，具有普通生態環境植物所不具備的特點和利用價值。課題組前期對云南黃芪屬植物的化學成分進行了廣泛研究［7?9］，并初步探討了某些植物的抗血小板活性。研究發現，與正品黃芪成分高度類似的梭果黃芪Astragalus ernestiiComber 和與正品黃芪成分區別很大的云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch 均能抑制血小板聚集，但作用途徑差別較大［10］。由于血小板活化在血栓形成中扮演主要角色［11］，本研究計劃進一步研究這2 種云南屬植物的抗血栓活性，并評價其出血風險，為初步了解云南黃芪屬植物在心血管疾病中的應用價值提供數據支持。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 大鼠，雄性，體質量180～200 g；SPF 級昆明種小鼠，雌雄各半，體質量20～24 g，均由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK（湘）2019?0004。

1.2 試劑與藥物 正品黃芪購自大理下關萬花路健之佳藥店，產地甘肅，批號20 180102；云南黃芪、梭果黃芪均采自香格里拉，經大理大學張德全教授鑒定為云南黃芪Astragalus yunnanensisFranch、梭果黃芪Astragalus ernestiiComber。水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號Q／12HB4218?2017）；阿司匹林（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號H172201）；注射用尿激酶（南京南大藥業有限責任公司，批號20200801）；血栓素B2（TXB2）試劑盒、6?酮?前列腺素F1α（6?K?PGF1α）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20210108）；含129 mmol／L 枸櫞酸鈉采血管、不含抗凝劑采血管（成都瑞琦醫療科技有限責任公司，批號20201024、20201508）。

1.3 儀器 0408?2 型臺式低速離心機 ［上海醫療器械（集團）有限公司］；恒溫水浴鍋（金壇市環保儀器廠）；Varioskan LUX 型功能酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

2 方法

2.1 提取物制備 將正品黃芪、云南黃芪、梭果黃芪的干燥根分別粉碎成粗粉，依次用75%乙醇提取1 h，95%乙醇提取2 h，95%乙醇再提取2 h，提取液減壓濃縮后得到浸膏，經冷凍干燥后得到凍干粉，實驗時用生理鹽水稀釋至相應質量濃度。在體內、體外血栓形成實驗和出血實驗中，上述3 種提取物的劑量均根據預實驗結果確定。

2.2 體外血栓形成實驗 大鼠隨機分為陰性對照組，正品黃芪7.5、15、30 mg／mL組，云南黃芪7.5、15、30 mg／mL組，梭果黃芪7.5、15、30 mg／mL組，陽性對照組（250 U／mL尿激酶），腹主動脈插管取血至采血管中，在37 ℃下放置5 h 使血液凝固，取出血凝塊，放入生理鹽水中清洗至無明顯血水后，切成質量約為100 mg 的小段，置于含不同質量濃度相應藥物的1.5 mL EP 管中，在37 ℃下孵育24 h，陰性對照組放入生理鹽水孵育，最后取出并稱定剩余血凝塊質量，計算血栓溶解率，公式為血栓溶解率＝［（給藥前血栓濕質量－給藥后血栓濕質量）／給藥前血栓濕質量］ ×100%。

2.3 體內血栓形成實驗 大鼠隨機分為假手術組，模型組，正品黃芪150、300 mg／kg組，云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg組，陽性對照組（阿司匹林100 mg／kg），給藥組灌胃給予不同劑量相應藥物，陰性對照組和模型組均灌胃給予生理鹽水10 mL／kg，每天1次，連續7 d。采用FeCl3誘導頸總動脈血栓形成法造模，末次給藥30 min后，腹腔注射4 mL／kg 10%水合氯醛麻醉大鼠，分離左側頸總動脈置于封口膠條（3 cm×1.5 cm）上，20%FeCl3溶液浸透的濾紙條（1 cm×1 cm）環敷頸總動脈，濾紙接口處用血管夾輕夾確保濾紙緊貼，假手術組用生理鹽水代替FeCl3進行環敷，20 min 后取掉濾紙，生理鹽水沖洗3次，40 min 后腹主動脈取血，置于含129 mmol／L 枸椽酸鈉的采血管中，4 ℃、3 000 r／min 離心10 min，分離血漿，用于檢測血漿血栓素B2（TXB2）、6?酮?前列腺素F1α（6?K?PGF1α）水平。取血后，精確剪下1 cm 被濾紙條包裹過的頸總動脈血栓部位血管段，置于濾紙上吸干浮血，稱定含血栓的血管濕質量，取出血栓后再稱定質量，兩者相減，即得血管段內血栓的濕質量。

2.4 出血實驗 小鼠隨機分為陰性對照組，正品黃芪300、600 mg／kg組，云南黃芪300、600 mg／kg組，梭果黃芪300、600 mg／kg 組、陽性對照組（阿司匹林200 mg／kg），灌胃給予不同劑量相應藥物（陰性對照組灌胃給予20 mL／kg 生理鹽水），每天1次，連續4 d。采用切尾法測定尾出血時間，末次給藥1 h 后固定小鼠，距尾尖3 mm 處剪斷鼠尾，立即浸入37 ℃生理鹽水中，記錄從剪去尾尖到血流停止的時間，即為尾出血時間。

2.5 統計學分析 通過SPSS 26.0 軟件進行處理，數據以（）表示，組間總體差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響 與陰性對照組比較，尿激酶組，正品黃芪15 mg／mL組，云南黃芪15、30 mg／mL組，梭果黃芪15、30 mg／mL 組均能增加血栓溶解率（P＜0.05，P＜0.01），其中劑量為30 mg／mL 時溶解血栓的能力依次為云南黃芪＞梭果黃芪＞正品黃芪，15 mg／mL時依次為梭果黃芪＞云南黃芪＞正品黃芪，7.5 mg／mL時均不能增加血栓溶解率（P＞0.05），但各劑量下的作用均弱于尿激酶，見表1。

表1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響（，n＝6）

表1 各品種黃芪對體外血栓形成的影響（，n＝6）

注：與陰性對照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與正品黃芪組（30 mg／mL）比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 各品種黃芪對體內血栓形成的影響 與模型組比較，阿司匹林組，正品黃芪300 mg／kg組，云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg 組均能減少血栓濕質量（P＜0.05，P＜0.01），其中劑量為300 mg／kg 時溶解體內血栓的能力依次為梭果黃芪＞正品黃芪＞云南黃芪，150 mg／kg時依次為梭果黃芪＞云南黃芪＞正品黃芪，并且梭果黃芪上述作用與阿司匹林相當。與模型組比較，阿司匹林組，正品黃芪150、300 mg／kg組，云南黃芪150 mg／kg組，梭果黃芪150、300 mg／kg 組均能降低TXB2水平（P＜0.05，P＜0.01），而云南黃芪150、300 mg／kg組，梭果黃芪150 mg／kg 組均能升高6?K?PGF1α 水平（P＜0.05，P＜0.01）；與假手術組比較，模型組TXB2／6?K?PGF1α 升高，而各品種黃芪均能降低該比值（P＜0.05，P＜0.01），作用能力依次為云南黃芪＞梭果黃芪＞正品黃芪，見表2。

表2 各品種黃芪對體內血栓形成的影響（，n＝8）

表2 各品種黃芪對體內血栓形成的影響（，n＝8）

注：與假手術組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與正品黃芪組（300 mg／kg）比較，＃P＜0.05。

3.3 各品種黃芪對尾出血時間的影響 與陰性對照組比較，阿司匹林組，正品黃芪300 mg／kg組，梭果黃芪300、600 mg／kg 組均能延長尾出血時間（P＜0.01），而正品黃芪600 mg／kg 組、云南黃芪600 mg／kg 組均對其無明顯影響（P＞0.05），各品種黃芪出血風險依次為梭果黃芪＞正品黃芪＞云南黃芪，并且均低于阿司匹林，見表3。

表3 各品種黃芪對尾出血時間的影響（，n＝8）

表3 各品種黃芪對尾出血時間的影響（，n＝8）

注：與陰性對照組比較，??P＜0.01。

4 討論

特殊生態環境指的是環境條件和生物種類明顯不同于普通生態環境的生存環境，如高海拔、寒冷、沙漠等。生長于特殊生態環境中的植物（黃芪、天山雪蓮、藏紅花等）往往含有特殊使用價值的化學成分。本課題組已對云南黃芪屬植物的分布、生藥學和化學成分做了系統的研究，發現除了梭果黃芪和黑毛多枝黃芪含有與正品黃芪類似的成分外，其余云南黃芪屬植物所含成分均與正品黃芪存在很大的差異性，這可能會帶來云南黃芪屬植物與正品黃芪在功能上的差異。本研究表明，同等劑量下，云南黃芪和梭果黃芪溶解體外血栓能力強于正品黃芪；梭果黃芪抑制FeCl3誘導動脈血栓形成的能力最強，而云南黃芪降低TXB2／6?K?PGF1α 比值的能力最強。這些結果表明2 種云南特殊生態環境的黃芪治療血栓性疾病的潛力高于正品黃芪。

盡管2 種黃芪均有抗血栓的作用，但是具體作用途徑有差別。一定濃度的FeCl3能損傷血管內皮，從而活化體內血小板和凝血系統，形成局部動脈血栓［12］。血小板活化在動脈血栓形成中有及其重要的作用，血栓素A2（TXA2）和前列環素I2（PGI2）均由血小板產生，前者促進血小板聚集和收縮血管，后者抑制血小板聚集和舒張血管，在生理狀態下，兩者保持動態平衡，而在血栓性疾病（如動脈粥樣硬 化、冠心病、高脂血癥）中，TXA2／PGI2比值升高［13?14］。由于TXA2和PGI2在體內的半衰期很短，可通過它們的代謝產物TXB2和6?K?PGF1α 的含量來代表它們在體內的水平［15］。本研究通過比較2 種黃芪對TXB2和6?K?PGF1α 的作用發現，梭果黃芪降低血栓中過度升高血栓素的能力更強，而云南黃芪能更顯著升高血栓中被降低的前列環素水平，并具有較強的降低TXA2／PGI2比值的能力。因此，2 種黃芪抗血栓的作用均與抗血小板活性有關，有所區別的是，梭果黃芪主要抑制血栓素活性，而云南黃芪主要增加前列環素活性。同時，課題組前期研究也發現了2種黃芪抗血小板聚集活性的差異，梭果黃芪抑制二磷酸腺苷（ADP）誘導血小板聚集的能力更強，而云南黃芪主要抑制花生四烯酸（AA）誘導的血小板聚集［10］。這些結果均表明，梭果黃芪可能更多地影響激動劑（如血栓素和ADP）對血小板受體的激動作用來抗血栓，而云南黃芪可能主要影響血小板代謝途徑來抑制血栓形成。2 種黃芪抗血栓活性的差異可能與其所含化學成分含量的差別和種類差異有關。課題組研究發現，梭果黃芪含有與正品黃芪類似的環阿屯烷型三萜皂苷類化合物［8］，而云南黃芪的化學成分大多為甾體類成分，未見環阿屯烷型三萜皂苷［9］。因此，盡管均有抗血栓活性，2 種黃芪的作用機制可能存在差異。需要注意的是，雖然梭果黃芪具有較強的體外和體內抗血栓活性，但是也有較強的出血風險，可增加小鼠尾出血時間，不過與陽性藥阿司匹林比較，梭果黃芪的抗體內血栓作用相當，而出血風險明顯降低。此外，云南黃芪對于體內血栓作用的風險／效益比較好，也具有開發潛力。

綜上所述，相較于正品黃芪，云南特殊生態環境中的黃芪屬植物更具有抗血栓藥物開發潛力，但其作用機制有待進一步闡明。