基于網絡藥理學探討祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤的作用機制

龍立活 陸永梅何佳 高紅偉 奉建芳 唐紅珍

（1.廣西藥用植物園， 廣西 南寧530012； 2.廣西中醫藥大學， 廣西 南寧530200）

子宮肌瘤是良性子宮腫瘤最常見的形式，臨床主要治療策略以手術干預和激素調控為主，存在患者依從性差、藥物副作用多以及疾病復發率高等問題，嚴重影響女性的身心健康，也對全球衛生保健服務和成本具有深遠的影響［1?4］。因此，亟需尋找和發掘兼得有效緩解疾病癥狀和不影響生育功能的治療藥物。

祛瘀散結膠囊是由白花蛇舌草、白英、山慈菇、夏枯草、三七等15 味中藥制成的膠囊劑，多用于治療瘀血阻絡引起的乳房脹痛、乳腺增生病、乳癖等疾病，因其具有祛瘀消腫、散結止痛等功效，臨床上也被應用于子宮肌瘤治療，已取得良好治療效果，具有廣泛應用前景，但因其成分復雜，目前仍未見其干預子宮肌瘤的有效成分及機制報道［5?6］。

中藥復方是一個復雜的多成分?多靶點交互體系，它的藥效不是簡單的藥味加和，而是各藥味間相互影響，網絡藥理學在揭示中藥復方的復雜成分及治病機理時，不僅需要對復方中各藥物成分進行獨立分析，還要對藥物間的關系進行綜合性討論［7］。本研究擬通過網絡藥理學和分子對接技術探討方劑?藥物?成分?靶點?通路?疾病間的聯系，采用相關動物實驗加以驗證，旨在為研究祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤的作用機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 祛瘀散結膠囊活性成分及靶點收集 采用ETCM（http：／／www.tcmip.cn／ETCM／index.php／Home／）、TCMSP（https：／／tcmsp?e.com／user／login／index.html）等數據庫及相關文獻，以“白花蛇舌草”“白英（白毛藤）”“山慈菇”“夏枯草”“三七”“土鱉蟲”“蜈蚣”“山楂”“枳殼”“仙鶴草”“苦楝皮”“冰片”“黃芪”“麥芽”“甘草”為關鍵詞，對祛瘀散結膠囊中各藥味的成分信息及相關靶點進行收集，將所得成分在TCMSP 中按照口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug?likeness，DL）≥0.18 的藥物動力學（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）參數條件進行初篩，獲取主要活性成分，采用Uniport（https：／／www.uniprot.org／）及 NCBI Gene（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／gene）對所得蛋白和其基因信息標準化為相應基因簡稱。

1.2 疾病靶點預測及交互靶點 以“Uterine fibroide”“Uterine fibroids”“fibroid”作為檢索詞納入人類基因數據庫（GeneCards）（https：／／www.genecards.org／）進行高級檢索，獲得子宮肌瘤相關靶點，再采用網絡藥理學蛋白交集Venny 2.1.0（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）在線工具獲得“祛瘀散結膠囊”與“子宮肌瘤”交集的“中藥?疾病”交互蛋白靶點，并繪制韋恩圖。

1.3 交互靶點蛋白互作（PPI）網絡構建 將“1.2”項下得到的交互靶標導入STRING（https：／／string?db.org／）數據庫，選擇Multiple Protenin，限定物種Homo sapiens，最低要求互動分數為“medium confidence”（＞0.4），其余設置均遵循系統默認，構建蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網絡圖。

1.4 交互靶點GO 和KEGG 富集分析 將交集靶標導入STRING 數據庫中，設置條件為閾值P＜0.05，物種來源為Homo sapiens，進行基因功能富集分析和KEGG 通路富集分析，從細胞組成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）及KEGG 信號通路等方面提供基因功能的詳細注釋。

1.5 交互靶點分子對接 從PubChem 數據庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）獲取主要活性成分sdf 格式的2D 結構，用ChemBio3D 能量最小化轉化為三維結構，保存為mol2 格式；從RCSB PDB 數據庫（https：／／www.rcsb.org）獲取PDB 號下載下載靶標蛋白的3D 結構，并使用PyMol 軟件刪除水分子和原配體。以蛋白作為受體，以小分子作為配體，根據靶蛋白復合物中配體的坐標確定分子對接的活性位點，采用AutoDock Vina 進行分子對接，用PyMol 進行相關作圖。

1.6 試劑與藥物 祛瘀散結膠囊（批號Z20026689），購自廣西圣康制藥有限公司。苯甲酸雌二醇注射液［2 mg／mL，批號（2016）110252511］、黃體酮注射液（10 mg／mL，批號110251670），均購自寧波第二激素廠；米非司酮（陽性藥，批號M830038），購自上海麥克林生化科技有限公司；大鼠雌二醇（E2）ELISA 試劑盒（批號MM?0575R1）、大鼠雌激素受體（ER）ELISA 試劑盒（批號MM?0567R1）、大鼠孕激素受體（P）ELISA 試劑盒（批號MM?0551R1），均購自江蘇酶免實業有限公司。

1.7 儀器 OHAUS 1／1000 型電子天平，購自奧豪斯儀器（上海）有限公司；BCD?143KA1 型電冰箱，購自TCL 科技集團股份有限公司；PM?10AD 型顯微鏡、BX?60 型病理圖像分析儀，均購自日本Olympus 公司；MP60 型顯微照相系統、RM2125 型切片機，均購自德國Leica 公司；5425R 型低溫高速離心機，購自德國Eppendorf 公司；Synergy H1 型酶聯免疫檢測儀，購自美國BioTek 公司；TP?24 型組織研磨機，購自杰靈儀器制造（天津）有限公司。

1.8 動物 雌性SD 大鼠，未孕，體質量200～220 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2019?0001，飼養條件為室溫（25±2）℃，相對濕度40%～70%，自然明暗周期，自由飲食。本實驗獲得廣西中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（編號DW20210621?035）。

1.9 造模、分組及給藥 SD 大鼠適應性飼養3 d后，采用雌激素負荷法造模，除正常組外，各組大鼠每天均給予肌肉注射苯甲酸雌二醇（0.5 mg／kg），隔天每只大鼠增加注射黃體酮（1 mg／kg），連續注射9周，每天稱定體質量1次，并根據體質量調整造模藥物用量，經大鼠子宮病理學顯示腺體增生及肌纖維明顯增生，提示造模成功。造模成功的大鼠按體質量隨機分為5組，每組8只，米非司酮組每天腹腔注射米非司酮1.25 mg／kg，祛瘀散結膠囊各劑量組灌胃給予0.3、0.6、0.9 g／kg 祛瘀散結膠囊，正常組及模型組每天灌胃給予等量生理鹽水。在正常情況下，大鼠子宮質量與體質量的比值，即子宮系數恒定；當子宮受損發生充血、水腫或增生肥大等狀態后，子宮系數增大，數值越大表示受損程度越重。

1.10 檢測指標

1.10.1 子宮病理學檢查 給藥期間觀察各組大鼠行為學狀態，給藥4 周后打開大鼠腹腔，觀察子宮和肌瘤形態，沿子宮膀胱連接處剪取子宮，剝離脂肪，拍照，稱定質量，計算子宮系數；將新鮮病變組織于多聚甲醛溶液中固定，行HE 染色。

1.10.2 雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受體（ER）水平檢測 大鼠腹腔麻醉后腹主動脈取血，收集全血于無抗凝采集管中，室溫放置30 min，4 ℃、3 000 r／min 離心20 min，分離得血清，分裝后保存于－80 ℃待測；精密稱取剩余子宮組織100 mg，加冰生理鹽水0.9 mL，使用組織研磨機研磨，4 ℃、10 000 r／min 離心10 min，取上清液待測，按相應試劑盒說明書檢測血清及子宮組織中雌二醇（E2）、孕酮（P）、雌激素受體（ER）水平。

1.11 統計學分析 通過GraphPad Prism 7 軟件進行處理，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析

2.1.1 祛瘀散結膠囊活性成分篩選 通過ETCM、TCMSP數據庫檢索共獲得祛瘀散結膠囊1 015 種成分，按照TCMSP 中設定的ADME 參數條件篩選并去除無靶點化合物，刪除重復靶點后得到活性成分為132個，共計268 個靶標，具體見表1。其中，潛在靶標個數較多的活性成分有槲皮素、山柰酚、木犀草素、芒柄花黃素、β?谷甾醇等，其靶標個數分別為148、62、56、45、38。

表1 祛瘀散結膠囊包含的化合物和對應潛在靶標個數（個）

2.1.2 子宮肌瘤靶點預測及“祛瘀散結膠囊?子宮肌瘤”交互靶點篩選 通過GeneCards 數據庫數據，以“fibroid”“Hysteromyoma”“Uterine fibroid”作為檢索詞收集得到子宮肌瘤治療相關靶點共計996 個。通過網絡藥理學蛋白交集Venny 2.1.0（https：／／bioinfogp.cnb.csic.es／tools／venny）在線工具獲取“祛瘀散結膠囊”與“子宮肌瘤”交集的“中藥?疾病”交互靶點共52個，為ESR1、PTGS2、NCOA2、PGR、BCL2、BAX、CASP3、MAP2、PPARG、MMP3、NOS3、RELA、EGFR、CCND1、CDKN1A、PLAU、MMP2、MMP9、IL10、TNF、CDKN2A、TP53、XDH、MMP1、HIF1A、ERBB2、GJA1、CYP1A1、VCAM1、PRKCB、BIRC5、CYP1B1、PLAT、THBD、PTEN、MPO、NFE2L2、COL3A1、CHEK2、INSR、SPP1、ERBB3、GSTM1、ESR2、CDK2、FASN、CYP19A1、PPARA、ADIPOQ、PCNA、EDN1、PLA2G4A，韋恩圖見圖1。

圖1 祛瘀散結膠囊與子宮肌瘤交互靶點韋恩圖

2.1.3 “祛瘀散結膠囊?子宮肌瘤”交互靶點PPI 網絡構建 利用STRING 數據庫對交互靶點進行蛋白互作網絡分析，繪制PPI 網絡圖（圖2），圖中網絡節點為52個，相互作用連線有527條，平均度值為20.3。節點表示由此蛋白質編碼基因位點單獨產生的所有蛋白，顏色表示聚類，大小反應度值；節點間的連線則表示連線兩端的蛋白存在直接或間接的相互作用；顏色反應作用類型和相互關系判定來源。

圖2 交互靶點PPI 網絡圖

2.1.4 “祛瘀散結膠囊?子宮肌瘤”交互靶點富集分析 從STRING 生物信息在線數據庫中確定GO 條目1 118條，生物學過程1 008條，主要涉及對含氧化合物、有機物質、化學品、脂質的反應，細胞對化學刺激、有機物質、含氧化合物的反應，調節細胞群增殖，對細胞過程的積極調節，生物過程的積極調節等；細胞組成33條，涉及子宮內膜系統、宿主細胞核、細胞質、蛋白復合物、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復合物、蛋白激酶復合物、細胞外空間、膜結合細胞器、胞內細胞器及細胞外區域等；分子功能77條，與信號受體、蛋白質、酶、同蛋白、過渡金屬離子、DNA 結合轉錄因子、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA結合轉錄因子、轉錄因子等結合及蛋白質結構域特異性結合等密切相關，以上分析均根據顯著性選取排名前十的條目作圖，具體見圖3。KEGG 富集信號通路137條，主要涉及癌癥通路、癌癥microRNA 通路、糖尿病并發癥AGE?RAGE 信號通路、液體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、內分泌抵抗信號通路、癌癥中的蛋白聚糖、HIF?1 信號通路等，根據其顯著性選取排名前20 的通路作圖，具體見圖4。

圖3 交互靶點GO 功能富集分析

圖4 KEGG 通路富集分析結果

2.1.5 分子對接 為了進一步驗證祛瘀散結膠囊有效化學成分的潛在靶標，將主要活性成分與潛在靶標進行分子對接。將交互靶點PPI 網絡圖的TSV 文件導入Cytoscape 3.6.0 中分析節點信息，篩選出前6 個核心調控基因靶點，結果見表2。以主要活性成分中潛在靶標數最多的槲皮素（quercetin）作為代表性成分，與TP53、TNF、CASP3、ESR1、MMP9 和INS 進行分子對接分析驗證，結果見圖5。

圖5 槲皮素與關鍵靶點分子對接的模式圖

表2 祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤關鍵靶點拓撲學分析

2.2 驗證實驗結果

2.2.1 祛瘀散結膠囊對大鼠行為學的影響 造模前各組大鼠性情溫和，毛色潤澤柔順，進食飲水良好；造模3 周后，大鼠出現毛色發黃、皮毛凌亂狀態，部分大鼠還有脫毛癥狀，且隨造模時間推移，脫毛大鼠數量增多，脫毛面積增大，且大鼠處于易激怒狀態，喜斗毆，善攻擊；祛瘀散結膠囊及米非司酮給藥后，大鼠情況有所改善，毛色有恢復跡象，情緒漸漸恢復穩定。

2.2.2 祛瘀散結膠囊對大鼠子宮形態的影響 如圖6A 所示，正常組子宮組織質地均勻，顏色鮮亮，兩側子宮對稱，呈Y形，未見結節或囊腫；模型組大鼠子宮根部明顯增粗，顏色黯淡，并可觸摸到有不同程度米粒大小腫塊；祛瘀散結膠囊各劑量組和米非司酮組大鼠子宮質地均勻，顏色較淡，未見明顯的囊腫、結節及腫脹，增生程度明顯減輕。如圖6B所示，與正常組比較，模型組大鼠子宮系數增加（P＜0.01）；與模型組比較，米非司酮組和祛瘀散結膠囊各劑量組大鼠子宮系數降低（P＜0.01），并呈劑量依賴性。結果提示，祛瘀散結膠囊對大鼠子宮肌瘤具有顯著的治療作用。

圖6 祛瘀散結膠囊對大鼠子宮形態的影響（，n＝8）

2.2.3 祛瘀散結膠囊對大鼠子宮組織病理變化的影響 正常組大鼠子宮平滑細胞排列整齊、緊密，形態正常，色澤均一，肌層未見炎性細胞浸潤，未出現增生；模型組大鼠子宮平滑肌增厚，細胞邊界不清晰，細胞核出現扁圓形狀，肌纖維排列紊亂無序，可見明顯炎性細胞浸潤；米非司酮組和祛瘀散結膠囊各劑量組大鼠子宮平滑細胞排列較為整齊，色澤均一，形態正常，肌層炎性細胞浸潤減少，病理狀態明顯改善，見圖7。

圖7 各組大鼠子宮組織HE 染色（×100）

2.2.4 祛瘀散結膠囊對大鼠血清E2、P、ER 水平的影響 如圖8 所示，與正常組比較，模型組大鼠血清E2、P、ER 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，祛瘀散結膠囊低劑量組血清ER 水平降低（P＜0.05），E2、P 水平無明顯變化（P＞0.05），米非司酮組和祛瘀散結膠囊中、高劑量組血清E2、P、ER 水平均降低（P＜0.05）。

圖8 祛瘀散結膠囊對大鼠血清E2、P、ER 水平的影響（，n＝8）

2.2.5 祛瘀散結膠囊對大鼠子宮組織E2、P、ER 水平的影響 如圖9 所示，與正常組比較，模型組大鼠子宮組織E2、P、ER 水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，米非司酮組和祛瘀散結膠囊各劑量組大鼠子宮組織E2、P、ER 水平均降低（P＜0.01）。

圖9 祛瘀散結膠囊對大鼠子宮組織E2、P、ER 水平的影響（，n＝8）

3 討論

本研究根據網絡藥理學方法預測得到，祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤有6 個核心調控基因，包括TP53、TNF、CASP3、ESR1、MMP9 和PTGS2。TP53 是最重要的抑瘤基因之一，已有研究發現子宮肌瘤患者p53 呈高表達［8?9］；TNF?α 參與炎癥反應及免疫應答，子宮肌瘤清除手術術前TNF?α 水平偏高的患者術后復發率更高［10］；子宮肌層的CASP3 是子宮靜止期的潛在調節因子；ESR1 編碼雌激素受體，對子宮肌瘤的生長有著重要影響［11?12］；MMP9 是人體最重要的蛋白酶之一，可降解腫瘤周邊基質和血管基底膜，促進腫瘤突破包裹增殖［13］；PTGS2 是前列腺素類生物合成途徑中的限速酶，在炎癥反應中起特殊作用［14］。KEGG 信號通路富集分析得到，祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤主要涉及癌癥通路、糖尿病并發癥中AGE?RGE 通路、液體剪切應力與動脈粥樣硬化通路、內分泌抵抗、HIF?1 通路等信號通路，祛瘀散結膠囊中活性成分對應的核心調控基因富集于癌癥通路。有研究表明，子宮肌瘤是一種性激素依賴性疾病，高雌激素長期刺激引起子宮肌層異常增殖，產生子宮肌瘤病灶；孕激素激活病灶處肌瘤細胞表面雌激素受體，促進肌瘤細胞生長繁殖，二者共同促進肌瘤生長。因此，激素相關的內分泌抵抗信號通路，是治療子宮肌瘤的重要途徑［15?17］。本研究發現，祛瘀散結膠囊能抑制子宮肌瘤模型大鼠血清與子宮組織中E2、P、ER 水平，降低子宮系數，減少肌瘤數量和大小，改善子宮病理狀態。癌癥通路和內分泌抵抗通路可能為祛瘀散結膠囊治療子宮肌瘤的關鍵通路。

槲皮素為祛瘀散結膠囊中多味藥物共有的活性成分，分子對接結果 顯示，槲皮素與 TP53、TNF、CASP3、MMP9、PTGS2 等關鍵靶標蛋白對接良好。已有研究表明，槲皮素具有良好的抗腫瘤作用，可下調PI3K?Akt 信號通路，抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲［18］；在SCG7901 細胞中，上調p53 的表達可抑制其增殖與遷移［19］；下調MMP9 蛋白的表達可實現對SiHa 細胞遷移和侵襲能力的抑制［20］。槲皮素還可通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（Cdkn1a）、半胱天冬酶3（caspase 3）等與細胞凋亡相關基因表達，提高β 細胞在高糖條件下的存活率［21］，抑制炎性介質TNF?α、PTGS2 的表達和基質金屬蛋白酶（MMPs）的生成［22］。槲皮素可能作為祛瘀散結膠囊中關鍵藥效分子參與治療子宮肌瘤。

綜上所述，本研究發現祛瘀散結膠囊可能通過多靶點、多通路治療子宮肌瘤，為其后續研究和臨床使用提供了新思路和理論基礎。但本研究仍存在一定的局限性，未對祛瘀散結膠囊具體作用機制作出深入探討，因此祛瘀散結膠囊的有效活性成分及完整調控機制仍需進一步研究來探討驗證。