60 Co?γ 輻照對大黃化學成分及抗菌活性的影響

毛騰霄 黃曉婧黃敏陳紅?汪洋

（1.成都市藥品檢驗研究院， 四川 成都610045； 2.四川省原子能研究院輻照保藏四川省重點實驗室，四川 成都610101）

大黃是廖科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.、唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］，含有多種化學成分，以蒽醌類衍生物為主。現代藥理學及臨床應用表明，該藥材具有抗菌消炎的作用［2?3］。

中藥材一般有一定的微生物負載，故降低菌量是藥材在生產、加工過程中的重要目標之一。60Co?γ 滅菌法是近年流行起來的新型消毒滅菌方法，它在常溫下消毒滅菌而不破壞藥材中易揮發成分及熱敏性物質，具有穿透力強、消毒均勻、快速等特點，目前已廣泛用于中藥材及其制品的滅菌［4?5］。目前，輻照滅菌所用劑量一般參照1997 年版《60Co 輻照中藥滅菌劑量標準》和2015 年版《中藥輻照滅菌技術指導原則》要求執行，前者規定中藥原粉能接受的輻照劑量不得過6 kGy，后者規定中藥最大總體平均輻照劑量原則上不超過10 kGy。課題組前期調研發現，在實際操作時同一次輻照可能包括幾種不同的物品［6］，為了保證輻照后衛生學指標都合格，一般選擇大劑量（10～15 kGy），個別品種甚至達到30 kGy，而且目前已有關于輻照引起中藥化學成分變化的報道［7?8］。本實驗模擬企業常用輻照劑量，采用HPLC 法比較輻照前后大黃總蒽醌、5種游離蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）含量的變化，再以管碟法檢測輻照前后對金黃色葡萄球菌的抑制作用，旨在為今后研究其他中藥輻照工藝提供依據。

1 材料

1.1 藥材 唐古特大黃、掌葉大黃均購自成都荷花池中藥材市場，經成都市藥品檢驗研究院中藥材市場質量監測研究重點實驗室鑒定為正品。

1.2 試劑與藥物 蘆薈大黃素（批號110795?201710）、大黃酸（批號110757?201607）、大黃素（批號110756?201913）、大黃酚（批號110796?201922）、大黃素甲醚（批號110758?201817）對照品及金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］均由中國食品藥品檢定研究院提供。抗生素檢定用培養基Ⅰ（含胨5 g、牛肉浸出粉3 g、磷酸氫二鉀3 g、瓊脂15 g、水1 000 mL，pH 7.9）、胰酪大豆胨液體培養基（批號200224?21）均購自北京陸橋技術股份有限公司。0.9% 無菌氯化鈉溶液為自制，滅菌后備用。

1.3 儀器 Waters 2695 液相色譜儀（美國Waters 公司）；AEG 220 電子天平（日本島津公司）；ZY?300Ⅳ多功能微生物自動測量分析儀（北京先驅威鋒技術開發公司）。

2 方法

2.160Co?γ 輻照 唐古特大黃、掌葉大黃粉碎后過4 號篩，分裝于無菌袋中，在四川省輻照中心進行60Co?γ 輻照，劑量設置為0、5、10、20、30 kGy（其中0 kGy 是未輻照處理），分別平行處理2 次。輻照完成后，立即進行各項指標檢測。

2.2 總蒽醌、游離蒽醌含量測定 參照2020 年版《中國藥典》“大黃”項下［9］方法處理藥材，經熱回流提取后過濾備用。

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量至250 mL 量瓶中，適量甲醇溶解，定容，制成分別含五者18.3、22.9、20.0、20.0、11.2 μg／mL 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

2.2.2.1 總蒽醌 取藥材粉末約0.15 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL至燒瓶中，揮去溶劑，加8%鹽酸10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.2.2 游離蒽醌 取藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件 Waters Bridge 十八烷基硅烷鍵合硅膠填料色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇?0.1%磷酸（85∶15）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL。

2.3 抗菌活性研究

2.3.1 水提物制備 取藥材50 g 至三角瓶中，加500 mL水，精密稱定質量，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后用文火再煮40 min，放冷，稱定質量，加 水補足減失的質量，3 000 r／min離心5 min，收集上清液并記錄其體積，旋轉濃縮至1 g／mL，即得。

2.3.2 試驗菌液制備 取金黃色葡萄球菌標準菌株適量，接種至胰酪大豆胨液體培養基中，在33 ℃下培養20 h，0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至1×104cfu／mL，即得。

2.3.3 測定方法 參照2020 年版《中國藥典》中的“抗生素微生物檢定法”制備雙碟，采用管碟法測定。取未輻照水提物，無菌水梯度稀釋成不同質量濃度，各質量濃度之間的劑距為0.8。測定1 批藥材時，取雙碟6只，各碟內間隔的3 只牛津杯中滴滿未輻照的水提物，另3 只牛津杯中滴滿同一劑量輻照后的水提物，在36 ℃下培養16 h，取出，游標卡尺測定抑菌圈直徑，取平均值，以質量濃度為橫坐標（X），抑菌圈直徑為縱坐標（Y）進行回歸，擬合量效關系方程。

2.4 統計學分析 通過SPSS 22.0 軟件進行處理，組間比較采用配對樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 HPLC 指紋圖譜 將總蒽醌、游離蒽醌含量的色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 年版）》，工作狀態選“分析檢驗”，以未輻照（0 kGy）藥材色譜圖為參照，設定多點校正、時間寬為0.1 進行全譜峰匹配，結果見圖1～2，相似度見表1。由此可知，4 個輻照劑量處理后與未輻照時2 種蒽醌HPLC 指紋圖譜的相似度均大于0.995，兩者峰高和峰形也無明顯差異。

圖1 輻照前后總蒽醌HPLC 指紋圖譜

圖2 輻照前后游離蒽醌HPLC 指紋圖譜

表1 相似度測定結果

3.2 總蒽醌、游離蒽醌含量 由表2 可知，輻照前后總蒽醌、游離蒽醌含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 輻照前后總蒽醌、游離蒽醌含量及抑菌圈直徑測定結果

3.3 相關成分峰面積 在總蒽醌HPLC 指紋圖譜中，唐古特大黃可標定出9 個共有峰，分別是T1～T9，而掌葉大黃可標定出9 個共有峰，分別是Z1～Z9；游離蒽醌HPLC 指紋圖譜中，唐古特大黃可標定出6 個共有峰，分別是Ta～Tf，而掌葉大黃可標定出5 個共有峰，分別是Za?Ze。將總蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關成分峰面積進行對數轉換后采用配對樣本t檢驗，結果見表3。由此可知，當輻照劑量達到30 kGy時，唐古特大黃T6 峰與0、5、10、20 kGy 劑量時比較具有顯著差異（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 劑量之間無顯著差異（P＞0.05）；掌葉大黃Z2 峰與0、5、10、20 kGy 劑量時比較具有顯著差異（P＜0.01），而0、5、10、20 kGy 劑量之間無顯著差異（P＞0.05）。同法處理游離蒽醌HPLC 指紋圖譜，相關成分峰面積見表4，可知各輻照劑量處理后其峰面積無顯著差異（P＞0.05）。

表3 總蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關成分峰面積測定結果

表4 游離蒽醌HPLC 指紋圖譜中相關成分峰面積測定結果

3.4 抗菌活性 輻照前唐古特大黃、掌葉大黃水提物的抑菌圈直徑見圖3，量效關系方程分別為Y＝0.447X＋16.45（R2＝0.985）、Y＝0.507X＋15.69（R2＝0.996），均在0.08～0.25 g／mL 范圍內線性關系良好。在上述量效關系方程中選擇質量濃度為0.16 g／mL，測定輻照前后抑菌圈直徑，結果見表2，可知均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 水提物抑菌圈直徑

4 討論與結論

輻照是一種有效的滅菌方法，雖然國家規定了中藥材的輻照劑量，但近年來發現實際運用中并未嚴格遵守。已有關于藥物經較高劑量輻照后產生降解產物的報道［10?11］。由于藥材輻照劑量隨意擴大具有普遍性，故本實驗考察了在當前常用劑量下對大黃有效成分、相關成分以及抗菌活性的影響。以期為輻照應用研究提供相關數據和依據。

大黃輻照前后總蒽醌和游離蒽醌HPLC 指紋圖譜相關數據經統計分析表明，主要成分蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量未發生變化（P＞0.05）。但當輻照劑量達到30 kGy時，總蒽醌含量指紋圖譜上唐古特大黃和掌葉大黃分別有一處有關成分峰響應極顯著增大（P＜0.01），說明輻照劑量增加會引起相關成分發生變化，值得進一步研究。

金黃色葡萄球菌是引起人類組織器官感染的重要致病菌［12?14］，據文獻報道，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素和大黃素甲醚均對其有抑制作用［15?16］。本研究在前期藥敏試驗時發現金黃色葡萄球菌對大黃水提物最敏感，這與前人報道一致［17?18］，故選為抗菌活性試驗菌株。根據2020 年版《中國藥典》“中藥生物活性測定指導原則”，本研究采用劑量梯度試驗，找到了藥物濃度與抑菌活性量效關系的線性關系范圍，從而確定了可作為比較輻照前后活性變化的濃度點。測定結果表明，在所選輻照劑量下，大黃抗金黃色葡萄球菌活性未發生變化。

由于輻照滅菌應用于中藥的歷史短，基礎研究尚需不斷完善，本研究僅考察了輻照前后大黃主要化學成分含量、相關成分和抗菌活性的變化，今后還應進一步對輻照敏感的成分進行鑒定分析，在穩定性等方面展開研究以保證用藥安全。