NCBP2基因在人神經膠質瘤中的表達與調節細胞凋亡的機制研究

吳鵬，薄威，郭麗，祁榮，王一維

（1.沈陽醫學院基礎醫學院科學實驗中心，遼寧 沈陽 110034；2.病理學教研室；3.人體解剖學教研室）

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，約占中樞神經系統（CNS）腫瘤的80%［1］。根據世界衛生組織（WHO）的CNS腫瘤分級，將膠質瘤分為Ⅰ～Ⅳ級。其中Ⅳ級膠質瘤最為常見并且侵襲性最強，又被稱為膠質母細胞瘤（glioblastomas，GBM）［2］。盡管臨床手術、放療和傳統化療取得了進展，GBM的預后仍然很差，中位生存期為14～16個月。低級別膠質瘤（low-grade gliomas，LGG）（WHOⅡ級）患者，盡管生存期可能超過10年，但預后仍不理想，因為這些腫瘤最終將發展為高級別膠質瘤（high-grade gliomas，HGG）（WHOⅢ或Ⅳ級）［3］。核帽結合蛋白亞基2（nuclear cap binding protein subunit 2，NCBP2）也稱為帽結合蛋白復合體2（cap-binding protein complex，CBC2）。有研究表明NCBP2以癌基因的表現存在于部分腫瘤之中，已被證實為卵巢癌的關鍵靶基因，并且在肺腺癌與肺鱗癌中表達上調［4］。NCBP2在人膠質瘤中表達情況鮮見報道，本研究擬探討NCBP2基因在人膠質瘤中的表達及調節細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質瘤細胞U87（上海中國科學院細胞庫）；shRNA慢病毒質粒（上海GeneChem公司）；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒與TUNEL凋亡試劑盒（武漢伊萊瑞特生物公司）；兔抗人NCBP2多克隆抗體與β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司）；Transwell小室（美國Corning公司）；凋亡流式檢測試劑盒（江蘇凱基生物有限公司）。BD Accuri C6 Plus流式細胞儀（美國BD公司）；ECLIPSE Ni-U光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1NCBP2在泛癌中的表達水平和在HGG、LGG及其亞型中的表達 利用GEPIA（Gene Expression Profiling Interactive Analysis）基因表達譜交互式分析平臺（http://gepia.cancer-pku.cn），分析NCBP2在泛癌中的表達水平和在HGG、LGG及其亞型中的表達情況。利用TCGA（The Cancer Genome Atlas）數據庫獲取膠質瘤LGG/GBM數據，分析NCBP2基因的表達差異并繪制受試者工作特征（ROC）曲線。

1.2.2 細胞培養與轉染 將U87細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養條件為5%CO237℃。在shRNA慢病毒質粒進行轉染，并用嘌呤霉素進行篩選。

1.2.3 Western blot實驗 刮取細胞，放入蛋白裂解液中2 h，提取總蛋白。用BCA試劑盒定量，測定濃度。樣品（20μg蛋白）經10%分離膠電泳后，轉膜。在用封閉液封閉1 h后，一抗孵育4℃過夜，二抗孵育37℃2 h，并通過ECL化學發光顯影。

1.2.4 MTT實驗 以3 000個細胞/孔的密度接種在6孔板中。在0、24、48和72 h時間點給予MTT溶液處理。孵育2 h后，將MTT溶液換成二甲基亞砜，在490 nm處測量每個孔的光密度。重復3次。

1.2.5 集落形成試驗 將U87細胞接種在6孔板（500～1 000個細胞/孔）中培養13 d。細胞用4%多聚甲醛固定，結晶紫染色。平板成像、菌落計數和統計分析。重復3次。

1.2.6 Transwell實驗 將U87細胞培養至對數生長期，用磷酸鹽緩沖液和無血清培養基先后洗滌1次，用無血清培養基懸浮細胞，計數，調整濃度。在下室加入600～800μl含10%胎牛血清的培養基，上室加入100～150μl細胞懸液（上室鋪膠為侵襲實驗），培養24 h。取出小室，甲醇固定，加入Giemsa染液。用濕棉棒小心擦去上室底部膜表面上的細胞。顯微鏡下取9個隨機視野計數，統計結果。重復3次。

1.2.7 TUNEL凋亡實驗 在96孔板中接種細胞，待細胞貼壁后，培養24 h，用4%多聚甲醛室溫下固定后，用磷酸鹽緩沖液、蒸餾水洗滌。用TrionX-100通透，洗滌后加入平衡緩沖液、核苷混合物和重組末端脫氧核苷酸轉移酶，37℃避光孵育2 h，洗滌后，加入4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，熒光顯微鏡下觀察。重復3次。

1.2.8 流式細胞術檢測細胞凋亡 將U87細胞（1×105個細胞/孔）接種于6孔板中并培養細胞，轉染后24 h；對照細胞為轉染空載后24 h。然后收集細胞，用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒進行染色，隨后用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或One-way ANOVA檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1NCBP2在膠質瘤中的表達上調 GEPIA可視化平臺分析了NCBP2在泛癌中的表達，結果發現NCBP2基因在LGG、GBM中表達顯著高于正常腦組織，見圖1A與B。提取TCGA的膠質瘤（689例）和GTEx中的正常組織（1 157例）數據，通過統計分析發現NCBP2基因在膠質瘤中表達上調，見圖1C。ROC曲線發現，NCBP2 mRNA表達水平能準確區分腫瘤與非腫瘤組織樣本，見圖1D。

圖1 NCBP2在膠質瘤中的表達上調

2.2NCBP2在膠質瘤亞型中的表達升高 利用GEPIA可視化平臺分別比較LGG亞型中星形細胞瘤型（98例）、少星形細胞瘤型（76例）和少突膠質細胞瘤型（116例）與正常腦組織（207例）中NCBP2的表達，結果顯示其在腫瘤組織中表達均升高，見圖2A。分別比較GBM的亞型中經典型（40例）、間充質型（55例）、神經元型（28例）和前神經型（37例）與正常腦組織（207例）中NCBP2的表達，結果顯示除神經元型外，NCBP2在其他亞型中表達均升高，見圖2B。

圖2 NCBP2在LGG亞型與GBM亞型中的表達

2.3 下調NCBP2基因抑制膠質瘤細胞的增殖能力為防止基因沉默的脫靶效應，我們設計了2個shRNA序列（shRNA#1、shRNA#2），通過Western blot法檢測轉染效率，顯示這2組U87細胞中NCBP2的蛋白表達均降低，見圖3A；MTT生長曲線發現沉默組U87細胞的增殖能力顯著下調，見圖3B；平板克隆形成實驗結果顯示沉默組U87細胞的克隆形成能力明顯受到抑制，見圖3C。

圖3 沉默NCBP2基因抑制膠質瘤細胞增殖能力

2.4 下調NCBP2基因抑制膠質瘤細胞侵襲與遷移能力 Transwell侵襲與遷移實驗結果顯示，與shNC組比較，沉默NCBP2組（shRNA#1與shRNA#2）遷移與侵襲的細胞數量顯著下調，見圖4。

圖4 沉默NCBP2基因抑制膠質瘤細胞侵襲與遷移能力

2.5 TUNEL染色檢測細胞凋亡 TUNEL染色檢測結果發現，shNC組細胞幾乎不存在TUNEL陽性細胞，在沉默NCBP2基因組（shRNA#1與shRNA#2）中可以觀察到高比例的凋亡陽性細胞，見圖5。

圖5 TUNEL染色檢測細胞凋亡水平

2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 流式凋亡實驗檢測結果發現，在人膠質瘤細胞U87中沉默NCBP2基因導致細胞凋亡率顯著升高，見圖6A和B；進一步通過Western blot結果顯示NCBP2基因沉默組Cleaved-PARP與Cleaved-caspase 3蛋白表達上調而Bcl-2蛋白表達下調，見圖6C。

圖6 沉默NCBP2誘導膠質瘤細胞凋亡

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤，其惡性程度高，預后差［5-6］。盡管有標準的治療方案，包括手術后放療和化療，膠質瘤患者的預后仍然很差［7-8］。其中GBM是最具侵襲性的類型，腫瘤的異質性是GBM最重要的標志之一，導致治療抵抗和腫瘤復發［9］。因此，想要有針對性地提高GBM患者的預后，應用個性化的治療策略尤為關鍵。CBC是NCBP1和NCBP2組成的異二聚體復合物［10］。當NCBP2直接結合mRNA的帽狀結構時，隨后NCBP1可以招募mRNA成熟所需的細胞因子，這樣保護了RNA聚合酶在轉錄過程中不被降解。CBC在mRNA從細胞核輸出到細胞質、mRNA的剪接及成熟等多方面功能中起重要作用［11］。

在本研究中，為明確NCBP2基因在膠質瘤中的表達，我們首先使用GEPIA可視化平臺分析發現NCBP2在LGG與GBM中表達上調。為進一步證實該基因在膠質瘤中的表達差異及臨床意義，我們從公開的TCGA數據庫中下載了689例樣本的基因表達信息及臨床資料、GTEx數據庫中1 157例正常樣本，通過統計分析顯示NCBP2基因在膠質瘤中表達上調；更值得關注的是ROC分析發現NCBP2是膠質瘤診斷的潛在生物學標志物。在果蠅的研究中發現，NCBP2的同源基因被敲除后能夠破壞神經細胞的增殖能力［10］。我們應用基因沉默技術，在人膠質瘤細胞U87中下調NCBP2基因，并通過Western blot檢測轉染效率，應用MTT實驗、克隆形成實驗與Transwell侵襲與遷移發現沉默NCBP2基因抑制人膠質瘤細胞增殖、侵襲與遷移能力。

細胞凋亡是一種細胞程序性死亡的過程，其特征是染色質濃縮、核碎裂、凋亡小體的形成、ROS水平的增加和caspases的激活，死亡受體途徑（外源性途徑）和線粒體凋亡途徑（內源性途徑）是導致細胞凋亡的2條主要途徑［12］。本研究發現，沉默NCBP2基因能夠促進人膠質瘤細胞的凋亡。Bcl-2是一種重要的癌基因，在細胞凋亡中起重要作用。Bcl-2蛋白家族主要調控細胞［13］。我們應用Annexin V-FITC和PI雙染色，通過流式細胞術檢測細胞凋亡情況，NCBP2基因表達下調組U87細胞凋亡率明顯上升，同時通過Western blot法結果顯示沉默NCBP2組細胞Cleaved-PARP與Cleavedcaspases 3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達下調。

綜上所述，本研究首次通過生物信息學，利用多種數據庫及可視化平臺分析了人類膠質瘤中NCBP2的表達情況，及該基因在膠質瘤中表達的重要意義。并且通過實驗驗證，沉默NCBP2基因后可以抑制人膠質瘤細胞U87的惡性生物學進程，并且誘導細胞的凋亡。