互葉白千層揮發油的化學成分及其抗腫瘤和抗蟲生物活性

張坤，崔云峰

（1.天津市南開醫院肝膽胰外科，天津 300100；2.天津醫科大學研究生院）

揮發油是存在于植物體內的一類具有揮發性的油狀液體，含有豐富的萜類和苯丙素類成分，具有廣泛的生物活性，如抗氧化、殺蟲、抗炎、鎮痛和抗腫瘤等［1］。目前，揮發油在抗腫瘤藥物研發和植物源農藥領域具有良好的應用前景［1-3］。惡性腫瘤嚴重危害人類生命健康，其中，乳腺癌已成為全球女性最常見的惡性腫瘤之一［4］。惡性黑色素瘤惡性程度和致死率極高，生長快、易局部復發和遠處轉移，居皮膚惡性腫瘤之首［5-7］。揮發油及其活性成分對很多惡性腫瘤細胞增殖具有顯著抑制作用，可有效延長或阻止腫瘤復發，具有治療及輔助治療的作用［2］。中藥材倉儲害蟲防治一直是中藥產業的薄弱環節，中藥材經蟲蛀后質地、功效發生變化，嚴重影響臨床用藥安全和療效［8］。其中，赤擬谷盜Triboliumcastaneum（Herbst）為危害最為廣泛的中藥倉儲害蟲之一，除直接危害外，其臭腺分泌液含苯醌等致癌物質［9］。揮發油對害蟲有很好的防治效果，對人畜毒性較低，不易產生抗藥性，已經成為有效解決化學農藥濫用的途徑之一［9-10］。互葉白千層揮發油又稱為茶樹油（TTO），具有許多生物活性，如殺蟲、抗菌、抗炎和抗腫瘤等，被廣泛用于日化、食品及醫藥衛生方面［11-12］。本實驗對揮發油的化學成分進行分析，并評價揮發油及主要成分的抗腫瘤和抗蟲活性，以期尋找抗腫瘤及抗蟲有效成分，為其開發應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自湖南豐暉生物科技有限公司，小鼠黑色素瘤細胞株B16購自中國典型培養物保藏中心。互葉白千層揮發油購于天津中澳嘉喜諾生物科技有限公司，γ-松油烯、（-）-萜烯-4-醇、1，8-桉樹腦和避蚊胺購自梯希愛（上海）化成工業發展有限公司，阿霉素購自大連美侖生物技術有限公司，胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM和RPMI 1640培養基購自美國Gibco公司，CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，青鏈霉素混合液（100×）雙抗、DMSO購自北京索萊寶科技有限公司，正己烷（分析純）購自天津津科精細化工研究所。

1.2 主要儀器 氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用儀（日本Shimadzu公司），酶標儀（美國Bio Rad公司），CO2恒溫恒濕培養箱（德國Binder公司），隔水式恒溫培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS分析條件 互葉白千層揮發油的化學成分采用GC-MS法進行鑒定，色譜柱為Rtx-5Sil MS柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）。取1μl 1%的互葉白千層揮發油溶液注入GC-MS聯用儀，不分流進樣，采用程序升溫，條件如下：最初溫度設定為85℃，保持4 min，然后以10℃/min升溫至200℃，最后以15℃/min升溫至280℃，保持10 min。離子源溫度230℃，進樣口溫度280℃，接口溫度290℃，掃描質量范圍80～600 m/z，離子化方式EI，載氣為高純氦氣，載氣流速1.0 ml/min。通過與NIST14.lib數據庫比對鑒定互葉白千層揮發油的化學成分，通過峰面積歸一化法確定各組分的相對百分含量。

1.3.2 細胞培養 MDA-MB-231細胞在DMEM培養基中培養，B16細胞在RPMI 1640培養基中培養。培養基中含10%的胎牛血清，100 U/ml的青霉素和0.1 mg/ml的鏈霉素。細胞在5%的CO2培養箱（37℃、90%濕度）中培養，待細胞匯合度達80%～90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化后傳代，每周傳代2～3次。

1.3.3 體外抗腫瘤活性 參照文獻［13］的方法，采用CCK-8法檢測互葉白千層揮發油及其主要成分體外抗腫瘤活性。取對數生長期的MDA-MB-231和B16細胞接種于96孔板，置于5%的CO2培養箱（37℃、90%濕度）中培養12～24 h，使細胞貼壁。移除培養基后，加入含有樣品的培養基溶液，每孔100μl，培養48 h，每組設5個重復孔，整個實驗重復3次。然后，加入CCK-8試劑顯色后，用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度值。

1.3.4 供試昆蟲 赤擬谷盜于2017年6月引種自北京師范大學資源學院。飼養條件：溫度28～30℃，相對濕度為70%～80%的培養箱中飼養。飼料配制：將小麥磨成細粉，加入5%酵母粉，攪拌均勻。試蟲傳代：將配制好的飼料分裝于0.5 L的廣口瓶中，每瓶接種40～50頭成蟲，置培養箱中，14 d后篩出成蟲，剩下含有蟲卵的面粉放入培養箱中繼續飼養，每周傳代1次，篩選1～2周成蟲作為供試昆蟲。

1.3.5 熏蒸測試 依據文獻方法［14］，對互葉白千層揮發油及其主要成分進行熏蒸活性測試。將10頭試蟲放入25 ml的螺口瓶中，然后用移液槍吸取10μl試藥（試藥用正己烷配制5個濃度梯度的試藥，揮發油濃度：50%、33.33%、22.22%、14.81%和9.87%，（-）-萜烯-4-醇、γ-松油烯和1，8-桉樹腦濃度：10%、6.67%、4.45%、2.97%和1.98%）滴于瓶蓋內的濾紙片上，另取正己烷處理作為對照，待溶劑揮干后，擰緊瓶蓋。每個濃度重復5次，整個實驗重復3次。將實驗組與對照組置于培養箱中培養24 h，觀察和記錄試蟲的死亡情況。

1.3.6 觸殺測試 依據文獻方法［9］，對互葉白千層揮發油及其主要成分進行觸殺活性測試。將供試昆蟲置于冰袋上，待試蟲不再移動，用移液槍吸取0.5μl試藥（試藥用正己烷配制5個濃度梯度的試藥，揮發油、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦濃度：30%、20%、13.33%、8.89%和5.92%，γ-松油烯濃度：8.75%、5.83%、3.89%、2.59%和1.73%）滴于試蟲的前胸背板上，處理后放入25 ml的螺口瓶中，每瓶10頭試蟲，正己烷處理作為對照，每個濃度重復5次，整個實驗重復3次。將實驗組與對照組置于培養箱中培養24 h，觀察和記錄試蟲的死亡情況。

1.3.7 驅避活性測試 依據文獻方法［9］，對互葉白千層揮發油及其主要成分進行驅避活性測試。將直徑為9 cm的圓形濾紙從中間剪成兩半，用移液槍吸取500μl試藥（5個濃度：78.63、15.73、3.15、0.63、0.13 nl/cm2）滴于其中一半濾紙上，另一半滴加正己烷作為對照，待溶劑揮干后，將濾紙黏貼在培養皿底部，把20頭試蟲均勻倒入培養皿中，每個濃度重復5次，整個實驗重復3次。將實驗組與對照組置于培養箱中，觀察記錄2、4 h時試蟲在兩邊濾紙的分布數量，計算驅避率（PR）。Nc=對照部分蟲數；Nt=給藥部分蟲數。

因為驅避活性有5個濃度，2個時間點，共10個PR，很難通過PR直接比較不同樣品的驅避活性，所以引入“灰色關聯度法”評價驅避活性［15］，通過相對關聯度ri大小比較樣品的驅避活性，ri值越大，驅避活性越顯著，相對關聯度ri的計算方法參照文獻［16］。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0軟件中的Probit analysis回歸分析，計算半數抑制濃度（IC50）、半數致死濃度（LC50）和半數致死量（LD50）。采用SPSS 22.0軟件中的ANOVA方差分析和Tukey檢驗，比較不同樣本PR的顯著性差異，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 互葉白千層揮發油的成分分析 所得到的GC-MS總離子流圖見圖1，揮發油成分分析見表1。由表1可知，從互葉白千層揮發油中檢測出30種成分，主要成分為（-）-萜烯-4-醇（36.02%）、γ-松油烯（21.42%）、2-蒈烯（10.56%）、萜品油烯（3.34%）和1，8-桉樹腦（3.17%）等。

圖1 互葉白千層揮發油GC-MS總離子流圖

表1 互葉白千層揮發油成分分析

續表1

2.2 互葉白千層揮發油及其主要成分的抗腫瘤活性 實驗結果表明，互葉白千層揮發油及γ-松油烯對B16細胞的增殖具有顯著的抑制作用，IC50分別為（12.02±1.46）和（17.47±5.38）μg/ml，而對MDA-MB-231細胞的增殖無顯著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml；（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦對MDA-MB-231和B16細胞的增殖無顯著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml；陽性對照阿霉素對MDA-MB-231和B16細胞的增殖均有顯著的抑制作用，IC50分別為（2.02±0.65）和（0.51±0.01）μg/ml。

2.3 互葉白千層揮發油及其主要成分的熏蒸和觸殺活性 熏蒸法和觸殺法結果表明互葉白千層揮發油顯示熏蒸（LC50=78.28 mg/L）和觸殺活性（LD50=52.37μg/頭），其主要成分1，8-桉樹腦（LC50=12.30 mg/L）對赤擬谷盜的熏蒸活性最為顯著，強于γ-松油烯（LC50=16.69 mg/L）和（-）-萜烯-4-醇（LC50=17.89 mg/L）。其主要成分γ-松油烯（LD50=167μg/頭）對赤擬谷盜的觸殺活性最為顯著，強于1，8-桉樹腦（LD50=38.12μg/頭）和（-）-萜烯-4-醇（LD50=45.46μg/頭）。見表2、3。

表2 互葉白千層揮發油及其主要成分對赤擬谷盜的熏蒸活性

表3 互葉白千層揮發油及其主要成分對赤擬谷盜的觸殺活性

續表3

2.4 互葉白千層揮發油及其主要成分的驅避活性

在濃度為78.63和15.73 nl/cm2時，揮發油和（-）-萜烯-4-醇在2 h的PR最高，均在70%以上；而在濃度為3.15 nl/cm2時，揮發油和1，8-桉樹腦在2 h的PR最高，分別為50%和36%；在濃度為0.63 nl/cm2時，揮發油和γ-松油烯在2 h的PR最高，分別為36%和16%；在濃度為0.13 nl/cm2時，揮發油和γ-松油烯在4 h的PR最高，分別為20%和10%。陽性對照避蚊胺，在低濃度0.13 nl/cm2時，PR在2 h和4 h均低于樣品，分別為-28%和-62%，在其他4個濃度，PR在2 h和4 h均高于樣品。見圖2。

圖2 互葉白千層揮發油及其主要成分對赤擬谷盜的驅避活性

由此可見，在不同的濃度和時間點，PR最高的樣品會有不同，所以通過PR很難直觀地評價哪個樣品的整體驅避活性最好，因此，本文引入“灰色關聯度法”評價驅避活性，互葉白千層揮發油驅避活性（ri=0.660 1）最為顯著，與陽性對照避蚊胺接近（ri=0.650 0），其主要成分（-）-萜烯-4-醇（ri=0.423 0）的驅避活性要強于γ-松油烯（ri=0.372 0）和1，8-桉樹腦（ri=0.369 1），見表4。

表4 互葉白千層揮發油及其主要成分驅避活性的相對關聯度

3 討論

本研究互葉白千層揮發油所含的主要成分為（-）-萜烯-4-醇（36.02%）、γ-松油烯（21.42%）、2-蒈烯（10.56%）、萜品油烯（3.34%）和1，8-桉樹腦（3.17%）等。據報道，巴西圣塔瑪麗亞產地的互葉白千層揮發油主要成分為萜烯-4-醇（34.6%）、γ-松油烯（20.3%）、α-松油烯（10.1%）和萜品油烯（4.2%）等［11］。廣西南寧產地的互葉白千層花與葉揮發油的主成分為1，8-桉樹腦（67.89%，68.14%）、α-松油醇（8.14%，10.59%）、檸檬烯（7.84%，8.54%）和α-蒎烯（3.18%，3.07%）等［18］。揮發油成分和含量的差異可能是由于地理位置、氣候、采收時間、儲存時間和提取方法的不同，這些變化可能會影響揮發油的生物活性［9，19］。

抗腫瘤活性結果表明，互葉白千層揮發油及γ-松油烯對B16細胞的增殖具有顯著的抑制作用，IC50均小于13μg/ml，而對MDA-MB-231細胞的增殖無顯著的抑制，IC50均大于100μg/ml，表明不同腫瘤細胞對同種物質的敏感程度是不同的。Qiu等［20］研究顯示阿霉素共聚物膠束DOX/KC對人胃癌MGC80-3細胞增殖的抑制作用（IC50=0.50μg/ml）強于B16細胞（IC50=0.90μg/ml）、人乳腺癌MCF-7細胞（IC50=1.54μg/ml）和人肺腺癌A549細胞（IC50=2.21μg/ml），這與不同腫瘤細胞細胞核對藥物的攝入速率相關，攝入速率越快對腫瘤細胞的毒性越大。此外，除互葉白千層揮發油和γ-松油烯外，揮發油中其他主要成分（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦對B16細胞的增殖無顯著的抑制作用，IC50均大于100μg/ml，說明γ-松油烯可能為互葉白千層揮發油抗B16細胞的有效成分。因此，相同的腫瘤細胞對不同成分的敏感程度存在差異，這可能與不同成分的化學結構差異相關，通過比較γ-松油烯、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦的化學結構和細胞毒性的關系發現，雙鍵可能會增強單萜類成分的細胞毒性。文獻也有對其他類型天然產物中雙鍵增強細胞毒性的報道，例如，大環雙聯芐類成分中的雙鍵可增強其對人宮頸癌Hela細胞、人慢性髓系白血病K562細胞、人結腸癌HT29細胞和人前列腺癌PC-3細胞增殖的抑制作用［21］。

抗蟲活性結果表明，互葉白千層揮發油對赤擬谷盜顯示熏蒸和觸殺活性，雖然不如陽性對照甲基溴和除蟲菊酯，但與其他一些運用相同生物測定方法的揮發油相比，互葉白千層揮發油對赤擬谷盜的毒性更大。例如，Ben Jemaa等［22］研究表明摩洛哥、阿爾及利亞和突尼斯月桂揮發油對赤擬谷盜熏蒸毒性的LC50分別為172.37、193.95和217.10μl/L，Liang等［23］研究表明灌木亞菊揮發油對赤擬谷盜觸殺毒性的LD50為105.67μg/頭。1，8-桉樹腦、γ-松油烯和（-）-萜烯-4-醇對赤擬谷盜具有較好的熏蒸活性，LC50均小于18 mg/L。γ-松油烯對赤擬谷盜具有較好的觸殺活性，LD50為17.67μg/頭，而（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦的觸殺活性不顯著，LD50均大于38μg/頭。由此可見，不同物質的抗蟲活性存在差異，同種物質不同作用方式的抗蟲活性強弱也不同。文獻也有類似報道，Feng等［14］研究表明，艷山姜葉揮發油的主要成分莰烯的熏蒸活性最為顯著（LC50=4.1 mg/L），而鄰-異丙基苯的觸殺活性最為顯著（LD50=18.1μg/頭）。此外，揮發油對赤擬谷盜的驅避活性最為顯著，ri值為0.660 1；而其他成分對赤擬谷盜的驅避活性不顯著，ri值均小于0.43?；ト~白千層揮發油、（-）-萜烯-4-醇和1，8-桉樹腦的驅避活性呈現濃度依賴性，隨著濃度降低，PR減小。驅避作用一般可以分成3種模式，一種是高效型（在高濃度下活性顯著，但隨著濃度的下降活性急劇下降）；另一種是持久型（在所有測試濃度下都有中等和穩定的活性）；另一種是兼有兩種類型的特點［14］。因此，互葉白千層揮發油屬于持久型，在低濃度仍然顯示驅避活性，而陽性對照避蚊胺屬于高效性，在低濃度驅避活性急劇下降，甚至呈現吸引作用。

綜上所述，本研究表明互葉白千層揮發油的主要成分為（-）-萜烯-4-醇、γ-松油烯、2-蒈烯、萜品油烯和1，8-桉樹腦等；揮發油和γ-松油烯對B16細胞具有顯著的抑制作用；1，8-桉樹腦、γ-松油烯和（-）-萜烯-4-醇對赤擬谷盜有顯著的熏蒸活性，γ-松油烯對赤擬谷盜有顯著的觸殺活性，揮發油對赤擬谷盜有顯著的驅避活性。以上結果為研究和開發互葉白千層揮發油及其活性成分作為抗腫瘤天然藥物和植物源農藥提供理論基礎，但其抗腫瘤和抗蟲機制還需進一步研究。