基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接篩選杜仲治療抑郁癥的潛在靶點和活性成分

楊萍，劉萍

（遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 遵義 563000）

抑郁癥是世界范圍內(nèi)精神致殘的主要原因，2017年世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)顯示，全球已有約3.22億抑郁癥患者［1］，且患病人數(shù)還在隨社會高速發(fā)展、老齡化加劇等持續(xù)上升［2］。目前，抑郁癥的病理生理學(xué)機制包括單胺假說、下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能亢進(jìn)等，但并不完善。在治療方面，臨床一線治療僅對1/3的患者顯現(xiàn)出明顯的改善作用，并且藥物起效作用存在數(shù)周至數(shù)月的潛伏期、藥物不良反應(yīng)嚴(yán)重［3］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，抑郁癥屬情志病范疇，正常的情志活動依賴于五臟氣、血和精的充盈與陰陽平衡，與肝腎功能及相互調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］，通過調(diào)節(jié)肝腎功能治療抑郁癥的療效也已得到認(rèn)可。杜仲，經(jīng)典補益藥，有補肝腎、強筋骨和安胎的功效。已有研究發(fā)現(xiàn)，杜仲可以顯著改善小鼠抑郁樣行為［5］，但作用靶點和主要的抗抑郁活性成分尚不完善。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，篩選杜仲治療抑郁癥的重要靶點，并運用分子對接考察杜仲主要活性成分基于該靶點治療抑郁癥的可能性，以期為后續(xù)研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 獲取抑郁癥靶基因 運用在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https://omim.org/）和人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https://www.genecards.org/）獲取疾病靶標(biāo)，并對結(jié)果進(jìn)行匯總?cè)ブ亍１疚牟捎脭?shù)據(jù)庫及軟件涉及“物種”選項均設(shè)置為“Homo Sapien（Human）”。

1.2 杜仲靶基因預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺（Traditional Chinese Medicines Systems Pharmacology，TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索“杜仲”，獲得的“Ingredients”特指所檢索藥物的活性成分。口服生物利用度（oral bio‐availability，OB）是衡量藥物體內(nèi)藥代動力學(xué)過程及成藥性的重要參數(shù)，類藥性（drug-like，DL）代表其成分和已知藥物化學(xué)結(jié)構(gòu)的相似度，對分析中藥活性成分是否可對機體產(chǎn)生作用具有重要參考價值。有研究顯示，OB≥30%且DL≥0.18對于活性成分成藥至關(guān)重要［6］，故本研究選取OB值≥30%且DL值≥0.18的活性成分，并在“Related Targets”項下查詢其對應(yīng)靶標(biāo)。后通過Universal Protein（UniProt，https://www.uniprot.org/）在線數(shù)據(jù)庫將獲得的靶標(biāo)轉(zhuǎn)換為基因名稱。

1.3 獲取交集基因并構(gòu)建活性成分-靶點-藥物-疾病的可視化網(wǎng)絡(luò) 將前述所得杜仲和抑郁靶基因分別輸入Venn在線工具，即可獲取兩者交集基因。使用Cytoscape 3.6.1軟件（http://www.cyto‐scape.org/）構(gòu)建可視化的活性成分-靶點-藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.4 獲取交集基因并構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò) 交集基因?qū)隨TRING 11.5在線數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)、獲取核心基因。

1.5 基因本體論（GO）和基因百科全書（KEGG）通路富集分析 聯(lián)合生物信息注釋數(shù)據(jù)庫（DA‐VID，https://david.ncifcrf.gov/）和R語言對核心基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

1.6 重要靶點與杜仲主要活性成分的分子對接通過數(shù)據(jù)庫查找杜仲主要活性成分，使用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載杜仲主要活性成分的二維結(jié)構(gòu)，依次在AutoDock‐Tools-1.5.6、Chem3D為其添加氫和電荷、修改使其能量最小化并以PDBQT格式保存。糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）（PDBID：1NHZ）的晶體結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PCSB PDB（http://www.rcsb.org）下載，下載的復(fù)合物使用PyMol 1.7軟件修飾以去除原始配體和水分子并保存為PDBQT格式。將以上準(zhǔn)備好的文件導(dǎo)入到Discovery Studio 3.5軟件進(jìn)行杜仲主要活性成分與NR3C1的分子對接和相互作用力分析，選擇能量最低的構(gòu)象作為分析的最優(yōu)構(gòu)象。

2 結(jié)果

2.1 抑郁癥靶標(biāo) 將2個數(shù)據(jù)庫獲得的基因進(jìn)行匯總?cè)ブ睾蠊驳玫揭钟舭Y基因9 720個，其中有1個來源于OMIM數(shù)據(jù)庫，其余來源于GeneCards數(shù)據(jù)庫。

2.2 杜仲靶標(biāo) 共獲得杜仲活性成分28個，后得到靶基因共181個。

2.3 交集基因及活性成分-靶點-藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)杜仲和抑郁癥交集基因共170個。使用Cytoscape 3.6.1軟件以展示藥物活性成分與靶基因（交集基因）之間的關(guān)系，見圖1，其中有4個活性成分與交集基因無連接，予以刪除。

圖1 杜仲主要活性成分-靶點-藥物-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò) 將交集基因?qū)隨TRING11.5在線數(shù)據(jù)庫以獲取核心靶點。通過設(shè)置最低相互作用得分為0.990，隱藏與主網(wǎng)絡(luò)無連接的點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2。圖中連線代表2個基因關(guān)聯(lián)，即基因共同促成或具備某功能。每一根連線代表一個該關(guān)聯(lián)的證據(jù)來源，如實驗、數(shù)據(jù)庫等，連線越多則證明兩者之間的關(guān)聯(lián)證據(jù)越充分，總連線越多的基因在網(wǎng)絡(luò)中的作用越核心，經(jīng)篩選后得到的此網(wǎng)絡(luò)中的基因即為杜仲治療抑郁癥的核心基因，共44個。

圖2 杜仲與抑郁癥PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO和KEGG通路富集分析結(jié)果 GO富集分析從細(xì)胞成分、生物途徑和分子功能3個方面對基因進(jìn)行描述，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測可知，杜仲治療抑郁癥的核心基因存在于核質(zhì)、細(xì)胞質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物和微管中心，通過參與機體對脂質(zhì)、有機物、有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)，調(diào)控生物發(fā)育，從而起到影響轉(zhuǎn)錄因子、酶、大分子復(fù)合物、染色質(zhì)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的作用，見圖3。KEGG通路富集分析見圖4，圖中P值代表富集程度，越小則富集程度越高，從上往下，P值逐漸增大。結(jié)果顯示，杜仲通過多通路協(xié)同作用治療抑郁癥，此處僅列出P值較小的前20個，其中包括內(nèi)分泌抵抗和凋亡信號通路。

圖3 杜仲治療抑郁癥的藥物-疾病核心基因GO分析圖

圖4 杜仲治療抑郁癥藥物-疾病核心基因KEGG分析

2.6NR3C1與杜仲主要活性成分的分子對接 本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究篩選得到杜仲治療抑郁癥的潛在調(diào)控靶標(biāo)共44個，并可通過PPI網(wǎng)絡(luò)對每個靶標(biāo)在網(wǎng)絡(luò)中的重要性進(jìn)行簡單分析。但網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)的研究，因為選擇方法、參數(shù)設(shè)置和計算模型的不完善使得一些作用靶點的得分排名較低甚至被剔除，結(jié)合文獻(xiàn)研究篩選靶點能部分減少這種錯誤。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，HPA軸功能紊亂是研究最深入、公認(rèn)對抑郁癥的發(fā)生發(fā)展極其重要的機制，在HPA軸的調(diào)控中，糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）發(fā)揮了重要作用，故本研究選取其調(diào)控基因NR3C1與杜仲主要活性成分進(jìn)行分子對接驗證。通過數(shù)據(jù)庫查找并得到杜仲主要活性成分7種，包括桃葉珊瑚苷、筋骨草苷、車前草苷、二氫查耳酮、哈帕苷丁酸酯、京尼平和馬錢苷。

Uniport網(wǎng)站查詢到NR3C1的（UniProtKBP04150（GCR_HUMAN））的氨基酸序列（500-777），該序列對應(yīng)的晶體結(jié)構(gòu)是NRLBD（圖6），PDB編號1NHZ，分辨率2.3A。NR3C1與各活性成分的分子對接結(jié)果見表1，可視化結(jié)果見圖5。

表1 NR3C1與杜仲主要活性成分的分子對接結(jié)果

圖5 NR3C1與杜仲主要活性成分的分子對接（3D結(jié)構(gòu)為NR3C1的NRLBD結(jié)構(gòu)域）

3 討論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法，探討杜仲治療抑郁癥的作用機制發(fā)現(xiàn)，杜仲中OB≥30%且DL≥0.18的活性成分共28個，24個與交集基因有連接；與抑郁癥的交集基因共170個，通過STRING在線數(shù)據(jù)庫篩選出杜仲治療抑郁癥的核心基因共44個。文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，核心基因中的NR3C1也是調(diào)控HPA軸的重要靶點，可能對抑郁癥有重要影響，故以其作為重要調(diào)控靶點進(jìn)行后續(xù)研究。為了進(jìn)一步發(fā)掘杜仲中基于NR3C1調(diào)控抑郁癥的成分，進(jìn)行分子對接發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷、筋骨草苷、車前草苷、二氫查耳酮、哈帕苷丁酸酯、京尼平和馬錢苷與NR3C1結(jié)合能均小于0 kcal/mol，分子之間有結(jié)合活性，具有進(jìn)一步研究的價值。

肝為將軍之官，一主疏泄、升發(fā)，調(diào)節(jié)全身氣機，使人體之氣向上向外，通而不滯，散而不郁，具有“陽”的生理特點，與抑郁癥情緒低落、悲傷易哭等“陰”性特征相互制約，彼此消漲；二主藏血，為神志活動提供物質(zhì)基礎(chǔ)，具有收斂之性，可化生和涵養(yǎng)肝氣［4］。肝之疏泄和藏血功能互為前提，維持人體氣、血的正常運行，從而保證機體發(fā)揮正常的情志活動。腎為作強之官，一主藏精，精是神志活動的根本，腎精充盈，可化生為血液，保證肝的藏血功能；二主閉藏，防止肝疏氣太過；另外，腎之陰陽為五臟陰陽之根本，腎陽是一切活動的動力之源，而抑郁癥表現(xiàn)出活動減少、興趣喪失等“不動”現(xiàn)象，可能與腎陽氣虧虛有關(guān)［4］。肝腎相互制約、相互影響，共同維持和調(diào)節(jié)五臟六腑陰陽氣血的平衡，在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展中起到重要的調(diào)節(jié)作用。目前，中醫(yī)理論討論肝郁為基礎(chǔ)，通過肝腎同調(diào)可能具有更好的應(yīng)用前景。但不論是從時間、物料投入等方面，都應(yīng)具充分的理論論證。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行深入分析，一方面論證補肝腎藥物治療抑郁癥的可行性；一方面預(yù)測可能的機制，二者相互驗證尋找研究具有抑郁癥治療前景的中藥活性成分。雖然網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選的研究已經(jīng)初具規(guī)模，但是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將中醫(yī)理論與現(xiàn)代藥理學(xué)結(jié)合還處于探索階段。深入的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可以為二者有機結(jié)合提供思路，并可以減少盲目投入，節(jié)約成本，提高研究效率。

檢索以上7種成分的抗抑郁研究發(fā)現(xiàn)，桃葉珊瑚苷［7］、京尼平［8］、馬錢苷［9］具有抗抑郁作用，但其作用機制不包括調(diào)控GR/NR3C1，進(jìn)一步梳理肝腎同調(diào)與HPA軸的關(guān)系，研究以上7種活性成分基于該軸的抗抑郁作用，或可為抑郁癥的機制和治療提供新的方案。本研究中使用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法不僅節(jié)約了人力、物力，更重要的是讓中醫(yī)理論能夠通過現(xiàn)代藥理學(xué)來解釋，其基于多成分、多靶點的相互結(jié)合的分析方法可能是中藥研究的突破點［10］。