氯化卡咪唑銨抑制鈣調蛋白與心肌CaV1.2通道結合的作用

郝明杰，孫偉楠，蘇敬陽，郝麗英

（中國醫科大學藥學院藥物毒理學教研室，沈陽 110122）

鈣調蛋白（calmodulin，CaM）是一種鈣離子（Ca2+）結合蛋白，通過與Ca2+結合調節機體的多種生物學功能，并在多種疾病中發揮作用［1-4］。CaM能夠與L-型鈣離子通道（L-type Ca2+channels，LTCCs）結合，調節通道的開放和關閉，影響細胞內Ca2+穩態，而細胞內Ca2+超載或濃度過低均會引發心血管系統疾病及神經精神疾病［5-6］。心肌中CaV1.2通道高表達，是Ca2+進入心肌細胞的主要途徑，通道的開放和關閉受Ca2+依賴性易化（Ca2+-dependent facilitation，CDF）和Ca2+依賴性失 活（Ca2+-dependent inactivation，CDI）的反饋調節，而以上過程均需CaM參與。研究［7-8］表明，CaV1.2和CaM的結合及其介導的Ca2+依賴的調節作用在生理學和病理生理學中具有重要作用。

氯化卡咪唑銨（calmidazolium chloride，CMZ）是一種以咪唑為基礎的特異性CaM拮抗劑。CMZ主要通過拮抗CaM依賴性磷酸二酯酶和CaM誘導的紅細胞Ca2+轉運ATP酶的活化，發揮拮抗CaM的作用［9］。本研究通過檢測CMZ存在下CaM與心肌CaV1.2通道的CT1基序蛋白片段的結合情況，探討CMZ調節細胞內Ca2+濃度的作用機制，為闡明相關疾病發生的潛在分子機制及深入理解疾病的病理生理過程、發現新的治療靶點，提供理論依據和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-3/CaM質粒由日本鹿兒島大學KAMEYAMA教授惠贈；pGEX-6P-3/CT1質粒購自上海生工生物有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物購自美國Oxid公司；氨芐西林（ampicillin，Amp）、異丙基-β-D硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、溶菌酶（lysozyme，Lys）以及N-月桂酰肌氨酸（N-lauroylsarcosine sodium，N-lau）購自美國Sigma公司；Triton X-100和磷酸鹽緩沖液（phosphate bufer，PBS）粉末購自北京Solarbio公司；谷胱甘肽瓊脂糖4B珠蛋白（glutathione-sepharose 4B beads，GS-4B beads）、PreScission酶購自英國GE Healthcar公司；CMZ購自中國MCE公司，溶解于二甲基亞砜中，現用現配制。

1.2 方法

1.2.1 融合蛋白的制備：將CaM的cDNA（GenBank FJ012165，人源CaM基因）和CT1（GenBank AB016287，豚鼠源CaV1.2通道基因 a.a.1509-1789）克隆入pGEX-6P-3質粒。在無菌條件下，應用42 ℃精確熱休克法將CaM和CT1重組質粒轉化至大腸桿菌BL21中。將菌液分別均勻涂布到含AMP的固體培養平板表面，于37 ℃培養箱中倒置培養12～16 h。挑取單克隆菌落于適量培養液中，震蕩培養至對數生長期（OD600約0.6～1.0），取800 μL菌液加入50%高壓滅菌過的200 μL甘油中混勻，-80℃冰箱中保留菌種。取60 μL菌種加入含有Amp的LB培養液中，37 ℃下空氣搖床中（110 r/min）振蕩培養10 h。次日清晨測得光密度OD600為0.8～1.2時，加入IPTG（終濃度為1 mmol/L）誘導蛋白表達4 h。采用超聲破碎法從菌液中提取純化GST-CT1和CaM蛋白。使用GS-4B beads純化CaM，并利用PreScission酶切除其GST標簽。應用BSA標準蛋白、BCA蛋白質定量試劑盒測量CaM濃度。GSTCT1蛋白離心（15 000g，10 min）后，取上清與預先用PBS清洗過的GS-4B beads過夜孵育。

1.2.2 融合蛋白的提純驗證：提取純化的GST-CT1和CaM融合蛋白各40 μL，加入15 μL 5×SDS loading buffer，充分混勻；煮沸5 min，蛋白變性，行15%SDSPAGE凝膠電泳。考馬斯亮藍R染色，脫色，拍照。

1.2.3 Pull-down assay實驗：將GST-CT1蛋白固定于用PBS清洗過的GS-4B beads上，4 ℃下緩慢旋轉孵育過夜。12 h后取40 μL GST-CT1與CaM（終濃度0.35、0.7、1.4、2.1、3.5 μmol/L）在300 μL體系的Tris buffer緩沖液中孵育。實驗分為2組進行，即對照組（GST-CT1+CaM）和CMZ組（GST-CT1+CaM+CMZ，CMZ終濃度為1 μmol/μL［10］）。在不同 Ca2+濃度（100 nmol/L和10 μmol/L）條件下，4 ℃孵育4 h后，用相應濃度的Ca2+緩沖液清洗體系2次。然后，將樣品重懸于SDSPAGE上樣緩沖液中，并在15%SDS-PAGE凝膠中進行電泳分離。考馬斯亮藍R染色，Scanwizard Bio軟件掃描并數字化，CS Analyzer軟件定量灰度值，利用SigmaPlot軟件繪制CaM與CaV1.2 CT1結合的擬合曲線。

1.3 統計學分析

結合配體（Y）用 Hills 方程擬合，單點擬合模型用 Hill 方程表示如下：Y=Bmax×［X］/（Kd+［X］）。其中Bmax為最大結合，［X］ 為自由配體濃度，Kd為表觀離解常數。

2 結果

2.1 融合蛋白的鑒定

對超聲破碎法提取的GST-CT1融合蛋白、Pre-Scission 酶切的CaM蛋白分別行15%SDS-PAGE凝膠電泳，經染色、脫色后，在表觀分子量約為54×103（GST-CT1）、26×103（GST）和16.7×103（CaM）處出現蛋白條帶（圖1），與預期結果一致。

圖1 純化后的GST-CT1和CaM的SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of purified GST-CT1 and CaM

2.2 CMZ對CaM與GST-CT1結合的影響

10 μmol/L和100 nmol/L Ca2+濃度下，CaM與CaV1.2 CT1均具有結合作用，且結合具有CaM濃度依賴性。加入CMZ后，CaM與CaV1.2 CT1結合明顯減少，且在10 μmol/L Ca2+濃度下結合減少更顯著（圖2、表1），表明CMZ能抑制CaM與CaV1.2 CT1的結合，且在高鈣條件下抑制更顯著。

圖2 CMZ抑制CaM與CT1基序的結合Fig.2 CMZ inhibits the binding of CaM to CT1 motif

為了能夠更加清晰直觀地了解CMZ對CaM與GST-CT1結合的抑制作用，對CMZ組和對照組的CaM（0.35～3.5 μmol/L）與GST-CT1的結合值進行了具體分析。結果如圖3所示，在Ca2+濃度為10 μmol/L和100 nmol/L時，CMZ顯著抑制CaM與CT1基序的結合，且隨著CaM濃度的增加，該抑制作用逐漸減弱，即在低CaM濃度時，抑制作用更顯著。最大結合量Bmax值在Ca2+濃度為10 μmol/L時＞100 nmol/L，而表觀解離常數Kd值減小。表明高鈣時CaM與CT1基序的結合親和力增加，結合量增多。加入CMZ后，Kd值增加，表明CaM與CT1基序的結合親和力降低，且在Ca2+濃度為100 nmol/L時結合親和力降低更多（表1）。以上結果表明，CMZ在鈣超載的情況下對CaM與CT1基序的結合抑制作用更佳。

表1 CaM與GST-CT1結合的參數Tab.1 CaM and GST-CT1 binding parameters

圖3 CMZ存在或不存在時CaM與GST-CT1的結合情況對比Fig.3 The binding comparison of CaM and GST-CT1 with or without CMZ

3 討論

細胞內Ca2+是作用于細胞受體并控制多種細胞功能外部信號的關鍵信使。細胞通過一系列調控過程，嚴密調控胞內Ca2+濃度水平，以調節多種生理功能。CaM是所有真核細胞中最主要的Ca2+感受器蛋白，它與Ca2+結合后構象發生變化，激活或抑制Ca2+通道，從而調控細胞內Ca2+濃度。細胞死亡、增殖異常和重大疾病等均與Ca2+穩態的失調關系密切。研究［11-12］發現，應用CMZ等CaM拮抗劑可通過刺激細胞內Ca2+的釋放和進入，干擾Ca2+依賴性調節，從而使細胞內Ca2+濃度增加。本研究中討論了Ca2+濃度為100 nmol/L（相當于生理狀態下細胞內的Ca2+濃度）和10 μmol/L（相當于心血管疾病發生時的細胞內鈣超載狀態）時［13-15］，CMZ對CaM與心肌CaV1.2通道CT1蛋白片段結合的抑制作用，結果表明，CMZ抑制了CaM與LTCCs CaV1.2 的結合，可能為應用CMZ后促使細胞內Ca2+濃度升高提供了新的理論基礎，但其具體機制有待進一步研究。

自CaM被發現以來，對其抑制劑的研究一直是研究熱點之一。研究表明，CaM拮抗劑有多種藥理作用及廣泛的臨床應用前景，如誘導多種腫瘤模型的細胞凋亡［16］，抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移，抑制小膠質細胞過度炎癥反應等，為治療帕金森病和阿爾茨海默病等與炎癥增加和小膠質細胞增殖相關的神經退行性疾病提供了基礎［17-18］。而且，一些CaM拮抗劑已被廣泛用作抗癌藥物、治療造血系統疾病藥物以及抗精神病藥物［19］。CMZ作為CaM的一種特異性抑制劑，其臨床應用具有廣闊前景，但也有研究［20］發現，CMZ可導致離體成年大鼠心肌細胞舒張功能受損，從而導致心臟疲勞，還會導致H9c2細胞內Ca2+水平升高，線粒體功能障礙，氧化和亞硝化應激，產生劑量依賴性的生長抑制，這些嚴重的不良反應限制了其臨床應用。但有也研究［21］表明，CaM拮抗劑使細胞內Ca2+濃度升高，可以通過線粒體途徑誘導血小板的凋亡，不影響血小板活化，但影響其黏附和聚集，提示CMZ可作為治療血栓的潛在有效藥物，未來可將其制作為合適的劑型或靶向CaM和（或）CaM依賴的系統，以減少不良反應。

綜上所述，本研究結果表明，CaM拮抗劑CMZ抑制了CaM與心肌CaV1.2通道 C末端CT1基序的結合，揭示了CMZ作為CaM拮抗劑的一種新的作用機制。為CMZ潛在作用的挖掘以及其他CaM抑制劑的新的作用機制研究提供了思路，也為將CMZ應用于臨床治療某些疾病提供了理論基礎。