MCC950對心肌梗死大鼠心功能的保護作用及其機制

王禹婷，石菲菲，張迪，馬淑梅

（中國醫科大學附屬盛京醫院心功能科，沈陽 110004）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是心肌缺氧和心肌細胞能量衰竭引起的心肌壞死，冠狀動脈阻塞引起的長期心肌缺血會加重MI。線粒體是真核生物產生能量和活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要場所，參與細胞凋亡和信號轉導，正常線粒體功能對調節氧化應激和細胞凋亡至關重要。MI后線粒體因心肌缺氧和再灌注而受損，ROS形成、線粒體分裂/融合平衡破壞、線粒體自噬異常、線粒體膜通透性增加和線粒體超微結構改變都會引起線粒體功能障礙，誘導心肌細胞凋亡。因此，改善線粒體功能障礙對于改善和維持MI后心肌細胞的正常功能至關重要。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體在MI的病理生理過程中起至關重要的作用，抑制NLRP3炎癥小體可減輕炎癥反應并改善MI誘導的心肌功能障礙。研究［1］表明，線粒體功能障礙和ROS產生可激活NLRP3炎癥小體，其激活進一步破壞線粒體的結構和功能。因此，靶向抑制NLRP3炎癥小體激活可能是MI的有效治療方案。MCC950是一種NLRP3抑制劑，可改善與NLRP3有關的多種炎癥疾病。研究［2］表明，MCC950可通過抑制MI后的早期炎癥反應，緩解MI小鼠心肌纖維化并改善心臟功能。MCC950能否通過改善MI導致的心肌線粒體功能障礙從而改善心功能，有待進一步研究。本研究建立大鼠MI模型，探究MCC950在MI導致的心肌損傷和心功能障礙中的保護作用，及其對氧化應激和線粒體功能的影響，為MCC950在MI治療中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

HE染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；冰凍切片ROS檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒（上海碧云天生物科技有限公司）；NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD-N、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn2、PGC-1α、TFAM、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）和GAPDH抗體（美國Abcam公司）；石蠟包埋機及切片機、冰凍切片機（德國Leica公司）；組織研磨儀（德國IKA公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；酶標儀（美國Bio Tek公司）；全自動化學發光分析系統（上海天能科技有限公司）。

1.2 動物分組和大鼠MI模型建立

將30只SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組、MI組和MCC950組，每組10只。假手術組大鼠麻醉后僅打開胸腔后縫合。MI組和MCC950組建立MI模型，大鼠麻醉后打開胸腔，結扎冠狀動脈前降支。MCC950組于術前30 min尾靜脈注射3 mg/kg MCC950。

1.3 超聲心動圖檢查大鼠心功能

對各組大鼠進行超聲心動圖檢查，記錄大鼠左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）、左心室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）和左心室舒張末期內徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）。

1.4 HE染色檢測大鼠心肌組織病理形態變化

將大鼠心肌組織在4%多聚甲醛中固定48 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋并制成厚4 μm的石蠟切片。切片經二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化及蒸餾水洗滌后，進行HE染色。染色后的切片經梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察并拍照，放大倍數為200倍。

1.5 ROS熒光探針檢測大鼠心肌組織ROS水平

將大鼠心肌組織制成冰凍切片，嚴格按照冰凍切片ROS檢測試劑盒說明書操作，檢測大鼠心肌組織ROS水平。將冰凍切片用DHE探針37℃避光孵育30 min，PBS洗滌，DAPI染色液室溫避光孵育30 min，PBS洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 ELISA檢測大鼠心肌組織SOD和MDA水平

嚴格按照檢測試劑盒說明書操作，檢測大鼠心肌組織勻漿SOD和MDA水平。將標準品和大鼠心肌組織勻漿樣本加入酶標板中，37 ℃孵育1 h，棄液，加入辣根過氧化物酶標記的抗體，37 ℃孵育1 h，棄液，PBST洗板3次，加入生物素標記的親和素，37 ℃孵育1 h，棄液，PBST洗板5次，加入TMB底物，37 ℃避光孵育15 min，加入終止液，酶標儀檢測450 nm吸光度值。

1.7 Western blotting檢測大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關蛋白及線粒體分裂、融合和生物發生相關蛋白表達

使用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，BCA法定量蛋白，將蛋白配置成蛋白樣品，煮樣使其充分變性，將樣品上樣于聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中，電泳分離蛋白，將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18、GSDMD-N、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn2、PGC-1α、TFAM和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，PBST洗膜，二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL化學發光，使用ImageJ軟件進行灰度分析，并計算蛋白相對表達量。

1.8 免疫熒光染色檢測大鼠心肌組織ASC斑點形成

將大鼠心肌組織制成冰凍切片，實驗前將切片置于室溫平衡30 min，PBS洗滌3次，2%牛血清蛋白室溫封閉1 h，ASC一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，DAPI染色液室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅液封片，熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。數據均符合正態分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey事后檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠心功能指標比較

與假手術組比較，MI組大鼠LVEF和LVFS明顯降低，LVESD和LVEDD明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠LVEF和LVFS明顯升高，LVESD和LVEDD明顯降低（P＜ 0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心功能指標Tab.1 Cardiac function indexes of rats in each group

2.2 各組大鼠心肌組織病理形態變化

假手術組大鼠心肌組織結構正常，細胞均勻分布，輪廓清晰，胞核與胞質邊緣分明。MI組大鼠心肌組織細胞紊亂，部分細胞可見不清晰及破裂現象，可見大量炎癥細胞浸潤。MCC950組大鼠心肌組織損傷較MI組損傷減輕，炎癥細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態表現 HE×200Fig.1 Pathomorphology of cardiac muscle tissue from rats in each group HE×200

2.3 各組大鼠心肌組織ROS水平

與假手術組比較，MI組大鼠心肌組織ROS熒光強度明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織ROS熒光強度明顯降低（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織ROS水平Fig.2 ROS levels in myocardial tissue from rats in each group

2.4 各組大鼠心肌組織氧化應激因子水平

與假手術組比較，MI組大鼠心肌組織MDA含量明顯升高，SOD含量明顯降低（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織MDA含量明顯降低，SOD含量明顯升高（P＜ 0.05）。見表2。

表2 各組大鼠氧化應激因子水平Tab.2 Levels of oxidative stress factors in rats from each group

2.5 各組大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達

與假手術組比較，MI組大鼠心肌組織NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白相對表達量均明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織NLRP3、procaspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白相對表達量均明顯降低（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達檢測結果Fig.3 Expression of NLRP3 inflammasome-related proteins in myocardial tissue from rats in each group

2.6 各組大鼠心肌組織ASC斑點形成

與假手術組比較，MI組大鼠心肌組織ASC斑點形成數明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織ASC斑點形成數明顯降低（P＜ 0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠心肌組織ASC斑點形成檢測結果Fig.4 ASC speck formation in myocardial tissue from rats in each group

2.7 各組大鼠心肌組織線粒體分裂、融合和生物發生相關蛋白表達

與假手術組比較，MI組大鼠心肌組織OPA1、Mfn2、PGC-1α和TFAM蛋白相對表達量明顯降低，Drp1和Fis1蛋白相對表達量明顯升高（P＜ 0.05）；與MI組比較，MCC950組大鼠心肌組織OPA1、Mfn2、PGC-1α和TFAM蛋白相對表達量明顯升高，Drp1和Fis1蛋白相對表達量明顯降低（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織線粒體分裂、融合和生物發生相關蛋白表達Fig.5 Expression of proteins related to mitochondrial division，fusion，and biogenesis in myocardial tissue from rats in each group

3 討論

MI是世界上發病率和死亡率最高的疾病之一，其特征是心肌細胞丟失和纖維化瘢痕形成，心臟肥大和纖維化在很大程度上導致心室壁增厚和變硬，最終導致心臟功能受損和隨后的心力衰竭。MI期間的無菌炎癥反應在瘢痕形成和受損心肌的重塑中發揮至關重要的作用，早期的炎癥反應可能會增加基質降解，導致梗死的心肌組織愈合并形成疤痕，然而炎癥反應加重和延長導致MI后心室重構和功能障礙。因此，適度調節MI后的炎癥反應對預防心力衰竭至關重要。

MCC950是NLRP3的選擇性抑制劑之一，具有緩解疼痛、抗氧化、調節自噬和抗衰老等作用。CHENG等［3］的研究表明，將MCC950加載到基質金屬蛋白酶9水解微球中可抑制粒細胞中炎性因子的分泌，改善心功能。本研究發現，MCC950可改善MI大鼠心功能和心肌組織病理損傷，提示MCC950對MI的潛在治療作用。此外，本研究還檢測了MCC950對MI大鼠心肌組織NLRP3炎癥小體相關蛋白表達的影響，結果顯示，MCC950降低MI大鼠心肌組織中NLRP3、pro-caspase-1、cleaved caspase-1、pro-IL-1β、pro-IL-18和GSDMD-N蛋白表達，并抑制ASC斑點形成。GSDMD是參與細胞焦亡發病機制的關鍵蛋白，可裂解為GSDMD-N 和GSDMD-C 結構域，GSDMD-N寡聚化并穿透質膜以引發細胞焦亡，從而誘導心肌損傷［4］。因此，MCC950對MI大鼠的心臟保護作用可能與其抑制心肌細胞焦亡有關，其具體機制有待進一步驗證。

ROS是線粒體呼吸或代謝的副產品，線粒體功能障礙時會產生過多的ROS，并對線粒體造成不可逆的損害，當其釋放超過內源性抗氧化能力時會誘發氧化應激，導致細胞死亡，這是MI發展的重要因素［5］。本研究發現，MCC950降低MI大鼠心肌組織ROS水平和MDA含量，并增加SOD含量，提示MCC950抑制MI誘導的心肌氧化應激，這可能與其改善線粒體功能障礙有關。線粒體分裂、融合以及線粒體生物發生是調節線粒體形態、大小、質量、數量和生物活性的主要控制方法，保護線粒體免受損傷。Drp1是線粒體分裂的主要介質，其通過與線粒體外膜上的Mff、Fis1、MiD49和MiD51 結合促進線粒體裂變［6-7］。研究發現，抑制 Drp1 的表達和活性可以改善心功能，LI等［8］的研究表明，黃芩素可通過KLF4-MARCH5-Drp1通路上調心肌細胞膜相關的MARCH5表達，下調Drp1表達，從而緩解心肌缺血再灌注損傷。LIU等［9］發現，注射microRNA-138抑制劑后MI小鼠Drp1表達下調，MI面積減小。本研究發現，MCC950降低MI大鼠心肌組織Drp1和Fis1蛋白表達，表明MCC950抑制MI導致的線粒體分裂。線粒體融合與分裂一起維持線粒體的正常結構和功能，融合依賴于線粒體跨膜GTP酶，包括介導線粒體外膜融合的Mfn1和Mfn2，以及介導線粒體內膜融合的OPA1［10］。OPA1分為具有較高分子量的L-OPA1和具有較低分子量的S-OPA1。再灌注損傷時，L-OPA1過度切割導致線粒體內膜嵴完整性喪失，細胞色素C和其他促凋亡因子釋放到細胞質中，并激活細胞凋亡［11］。OKATAN等［12］發現，心肌缺血再灌注導致Mfn2表達大幅下降，從而減少線粒體融合，表明Mfn2的異常表達與MI后線粒體融合的減少有關。本研究發現，MCC950增加MI大鼠心肌組織OPA1和Mfn2表達，表明MCC950增加MI大鼠線粒體融合。線粒體生物發生是指增加線粒體體積以滿足細胞能量需求的增加，從而補償線粒體的損失［13］。線粒體生物發生主要受PGC-1α調節，它可以激活TFAM等線粒體生物發生相關轉錄因子［14］。本研究發現，MCC950增加MI大鼠心肌組織PGC-1α和TFAM蛋白表達，表明其增加MI大鼠心肌線粒體生物發生。

綜上所述，本研究發現，MCC950降低MI大鼠心肌組織氧化應激，促進線粒體融合和生物發生并抑制線粒體分裂，從而改善心肌損傷，保護心功能，這可能與其抑制NLRP3炎癥小體激活有關。