miR-146a-5p靶向調控Notch2促進人晶狀體上皮細胞線粒體損傷誘導的細胞凋亡

武彬，丁雨溪，王靜，夏建平，馬立威，張勁松

（愛爾卓越眼科醫院眼科，沈陽 110003）

隨著人口老齡化的日益嚴重，白內障的發生率逐年遞增，已經成為影響老年人健康的嚴重問題［1］。白內障的發生、發展機制復雜，與多種生理進程密切相關，還與周圍環境暴露和表觀遺傳有關［1］。微RNA（microRNA，miRNA）對基因表達的調控是一種表觀遺傳調控機制。miRNA是短片段的非編碼RNA序列，長度約為20～22個堿基序列。研究［2］報道，晶狀體和白內障晶狀體樣本的中央上皮的miRNA表達譜不同，表明不同表達的miRNA可能在晶狀體發育和白內障發生中發揮作用。

miR-146a-5p是miR-146家族的成員，miR-146a是最新研究熱點之一，在多個物種中高度保守，人miR-146a位于5號染色體LOC285628基因的第2個外顯子上［3］。miR-146a-5p主要參與調控細胞的增殖、凋亡、分化和細胞發育［4-6］。胃癌、肺癌和前列腺癌中，miR-146a-5p水平低于癌旁組織。miR-146-5p可以調控食管鱗狀細胞上皮-間質轉化，通過直接與Notch2的3’非翻譯區（3’-untranslated region，3’-UTR）靶向結合，抑制Notch2的表達，從而發揮作用［7］。然而，關于miR-146a-5p在年齡相關性白內障中作用的研究很少。本研究探討了miR-146a-5p對人晶狀體上皮細胞（human lens epithelial cell，HLEC）凋亡的調控作用，采用實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）檢測白內障患者晶狀體上皮組織中miR-146a-5p的表達，確定miR-146a-5p為潛在的疾病生物標志物；建立體外細胞模型，通過過表達miR-146a-5p，探討其對細胞凋亡的影響以及線粒體相關蛋白的變化；并進一步驗證miR-146a-5p對Notch2 3’-UTR的靶向調控作用，以及miR-146a-5p對Notch2下游蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采集2018年12月至2020年10月間我院收治的白內障患者的晶狀體上皮樣本，通過完整的連續環形撕囊術獲得晶狀體上皮。所有患者均接受完整的術前眼科檢查，除年齡相關性白內障外無其他眼部疾病。根據晶狀體混濁分級系統Ⅲ的修訂版本，對白內障的類型和嚴重程度進行分級和記錄。選擇CN 4～6分、C 4～5分和P 4～5分（C，皮質性混濁；N，晶狀體核混濁；P，后囊下性混濁）的15例患者晶狀體為白內障組，患者年齡60～70歲，其中男8例，女7例。收集我院眼科眼庫新鮮人眼晶狀體上皮樣本15例為對照組，患者年齡55～65歲，其中男9例，女6例。本研究通過我院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 qRT-PCR

采用qRT-PCR檢測組織或細胞中miR-146a-5p的表達水平。應用miRNeasy試劑盒（德國QIAGEN公司）從總RNA中分離miRNA，并應用1 μg RNA和Prime Script RT試劑盒（日本TaKaRa公司）進行反轉錄，以U6為內參。使用SYBR Premix Ex Taq（日本TaKaRa公司）對特定產物進行3次擴增和檢測，并對數據進行分析。PCR反應條件：95 ℃預變性反應 15 min，94℃變性反應 15 s，55 ℃退火反應 30 s，70 ℃延伸反應30 s，40 個循環反應。

采用qRT-PCR檢測NDUFS8、SDHb、COX5b、ATP5a1mRNA的表達水平，以β-actin為內參，TRIzol法提取RNA后，反轉錄為cDNA。PCR反應條件：95℃預變性3 min，95 ℃變性反應 5 s，56 ℃退火反應30 s，72 ℃延伸反應 30 s，40 個循環反應。應用2-ΔΔCt法計算各組間mRNA的相對表達水平。

1.3 細胞培養和轉染

HLEC細胞系SRA01/04購自美國ATCC公司。在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2條件下培養。將miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC（中國上海生工股份有限公司）轉染到細胞中，采用Lipofectamine 2000轉染試劑進行轉染，轉染24 h后采用qRT-PCR檢測miR-146a-5p水平。

1.4 細胞凋亡檢測

采用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國eBioscience公司），將轉染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5p NC的細胞在轉染后48 h進行細胞凋亡檢測。按照試劑盒說明書，將轉染48 h后的SRA01/04細胞1 000g離心10 min，用預冷的PBS清洗，并重新懸浮在250 μL結合緩沖液中。將細胞與Annexin V-FITC和PI在室溫下黑暗中孵育15 min，隨后用流式細胞儀（美國BD 公司）進行分析。采用ImageJ軟件分析細胞凋亡情況。

1.5 Western blotting檢測

將消化后的SRA01/04細胞在放射免疫沉淀法裂解緩沖液中4 ℃裂解30 min。使用線粒體分離試劑盒（美國賽默飛公司）分離線粒體，蛋白定量、蛋白變性后，取30 μg蛋白在10%SDS-PAGE中分離，然后轉移到PVDF膜上，4 ℃下與caspase 9、caspase 12、細胞色素c（cytochrome c，Cyt c）、Notch2、Hey1、GAPDH抗體孵育過夜；與HRP標記的二抗結合后，采用ECL Plus化學發光試劑盒（美國GE醫療公司）檢測，采用ImageJ軟件進行灰度值分析。

1.6 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測

將轉染miR-146a-5p mimics和miR-146a-5pNC的胞，使用2’，7’-二氯二氫熒光素-二乙酸酯（DCFH-DA，美國Sigma公司）對細胞產生的ROS進行定量。細胞與10.0 μmol/L DCFH-DA在37 ℃下孵化30 min。采用熒光電鏡觀察細胞內熒光強度變化，拍照后，采用ImageJ軟件計算ROS水平。

1.7 生物信息學預測和雙熒光素酶報告基因實驗

采用TargetScan生物信息學網站（https：//www.targetscan.org/vert_42/）預 測miR-146a-5p 靶 點。采用雙熒光素酶報告基因實驗進行驗證，用含有10%胎牛血清的DMEM培養HEK293T細胞。將Notch2mRNA的野生型3’-UTR片段以及含有預測miR-146a-5p結合序列或無預測序列的miR-NC結合序列的構建體克隆到psiCHECK2熒光素酶報告載體中（美國Promega公司），分別為Notch2 3’-UTR WT+miR-146a-5p組 和Notch2 3’-UTR WT+miR-NC組。攜帶Notch2mRNA的3’-UTR突變片段以及結合序列的miR-NC也被克隆到psiCHECK2熒光素酶報告載體中，分別為Notch2 3’-UTR MUT+miR-146a-5p組 和Notch2 3’-UTR MUT+miR-NC組。將HEK293T細胞接種在24孔板中，用FuGENE 6（美國Promega公司）與10 μmol/L miR-146a-5p或miR-NC和2.5 μg psiCHECK2載體共同轉染，該載體含有Notch2 3’-UTR的突變或野生預測片段。擴增子被插入到熒光素酶報告基因的cDNA下游載體中。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告系統（美國Promega公司），自動微孔板測定儀測量相對熒光素酶表達，并計算活性值。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 miR-146a-5p在白內障患者晶狀體上皮中表達上調

與對照組相比，白內障組miR-146a-5p表達明顯上調（P＜ 0.05），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測白內障組和對照組晶狀體上皮中miR-146a-5p的表達Fig.1 Expression of miR-146a-5p in lens epithelial samples of cataract patients and control subjects detected by qRT-PCR

2.2 miR-146a-5p促進SRA01/04細胞的凋亡

qRT-PCR結果（圖2A）顯示，miR-146a-5p mimics轉染SRA01/04細胞后，miR-145a-5p處于過表達狀態。Annexin V和PI雙染色結果（圖2B）顯示，miR-146a-5p過表達增加了SRA01/04細胞的早期和晚期凋亡水平。檢測轉染后細胞中caspase 9和caspase 12表達的變化，結果（圖2C）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細胞中caspase 9表達水平顯著增高（P＜ 0.05），但caspase 12表達變化的差異無統計學意義（P＞ 0.05）。上述結果表明，線粒體功能紊亂是miR-146a-5p調控的第一步，通過caspase 9的激活引發miR-146a-5p誘導的細胞凋亡。

圖2 miR-146a-5p模擬物促進SRA01/04細胞凋亡Fig.2 miR-146a-5p mimics promotes apoptosis in lens epithelial SRA01/04 cells

2.3 miR-146a-5p通過誘導線粒體功能紊亂促進SRA01/04細胞凋亡

miR-146a-5p mimics轉染SRA01/04細胞后，MMP-2和MMP-9表達均下調（圖3A），表明miR-146a-5p mimics引發MMP蛋白破壞。進一步分離各組細胞中的線粒體和細胞質，Western blotting結果（圖3B）顯示，miR-146a-5p過表達導致Cyt c從線粒體轉移到細胞質。miR-146a-5p NC或miR-146a-5p mimics轉染SRA01/04細胞48 h后，qRT-PCR結果（圖3C）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細胞中NDUFS8、COX5b和ATP5a1mRNA的表達水平顯著下調（P＜0.05），表明線粒體電子運輸鏈被增強的miR-146a-5p表達阻斷。同時免疫熒光結果（圖3D）顯示，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組細胞中ROS水平下降。結果證實，miR-146a-5p過表達可能促進HLEC中ROS的釋放，激活氧化應激反應。

圖3 miR-146a-5p通過誘導線粒體功能紊亂促進SRA01/04細胞凋亡Fig.3 miR-146a-5p promotes the apoptosis of SRA01/04 cells by inducing mitochondrial dysfunction

2.4 Notch2是miR-146a-5p的功能靶點

TargetScan網站預測分析結果（圖 4A）顯示，Notch2 3’-UTR 中部分核苷酸序列能與 miR-146a-5p特異性互補配對。雙熒光素酶報告基因實驗（圖4B）發現，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組Notch2 3’-UTR WT載體的熒光素酶相對活性顯著降低（P＜ 0.05），而Notch2 3’-UTR MUT 熒光素酶相對活性無統計學差異（P＞ 0.05），結果表明，miR-146a-5p NC不影響突變體構建中的熒光素酶活性。Western blotting結果（圖4C）證實，與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組Notch2的表達明顯下調（P＜ 0.05）。

圖4 miR -146a-5p靶向結合Notch2的3’-UTR并下調Notch2的表達Fig.4 miR-146a-5p specifically targets the 3’-UTR of Notch2 and reduces its expression

2.5 miR-146a-5p對Notch2信號通路下游蛋白的影響

與miR-146a-5p NC組相比，miR-146a-5p mimics組SRA01/04細胞中Hey1蛋白表達明顯下調（P＜ 0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting檢測Hey1蛋白的表達水平Fig.5 Expression of Hey1 protein detected by Western blotting

3 討論

白內障是致盲的主要原因之一，與衰老過程密切相關。近期有研究報道，miR-146a-5p過表達能夠激活前列腺癌［4］和非小細胞肺癌［3］細胞凋亡，并引發細胞周期阻滯。同時，miR-146a-5p通過靶向調控Notch2的水平，影響心肌缺血再灌注大鼠的心肌損傷［8］。此外，miR-146a在多種細胞和組織中調控慢性炎癥反應［9］，而慢性炎癥可誘發機體的氧化損傷、DNA損傷和干細胞衰老，這些均與加速衰老密切相關［10］。基于上述研究報道，本研究通過qRT-PCR發現，miR-146a在年齡相關性白內障晶狀體上皮中表達上調。

大量研究［11］證實，多種因素與白內障的發生和發展密切相關，包括糖尿病、紫外線過量照射、不良藥物使用和其他眼部疾病等。上述疾病因素中，氧化應激和由氧化應激產生的ROS被認為是白內障的主要易感因素。LI等［12］的研究表明，晶狀體上皮細胞凋亡是哺乳動物非先天性白內障發生的特性表型。因此，本研究檢測miR-146a-5p過表達的HLEC中的凋亡生物標志物和細胞功能，結果表明，miR-146a-5p通過線粒體功能障礙激活HLEC凋亡，包括阻斷電子傳遞、形成ROS，進一步將Cyt c釋放到細胞質中，并觸發caspase 9激活。

為了鑒定miR-146a-5p的靶基因，本研究采用TargetScan靶預測工具，預測Notch2是miR-146a-5p的靶基因，并通過熒光素酶報告基因實驗進一步驗證了miR-146a-5p與Notch2的3’-UTR特異性結合，同時Western blotting結果證實miR-146a-5p與Notch2的表達呈負相關。1991年和1997年，WEINMASTER等［13］證實Notch受體分別在果蠅和發育中的大鼠眼睛中表達。對出生后大鼠晶狀體上皮細胞分化進行的體外研究結果表明，在成纖維細胞生長因子依賴的次級纖維細胞分化過程中，Notch2信號被激活，但未檢測到相應的Notch1激活。Notch2條件突變小鼠表現出嚴重的小眼畸形、纖維細胞形態破壞和白內障表型［14］。由此可見，Notch2突變和表達下調是白內障產生的主要原因之一。Hey1是Notch信號通路下游重要的調控蛋白，與胚胎血管形成有關［15］。本研究除發現miR-146a-5p抑制Notch2表達外，還發現Notch2下游的重要調控蛋白Hey1明顯下調，進一步證實miR-146a-5p對Notch2信號通路的抑制作用。

綜上所述，miR-146a-5p在白內障患者晶狀體上皮組織中表達上調，其過表達能夠促進HLEC凋亡，其作用機制與影響線粒體穩態和下調Notch2信號通路密切相關。