在肺結(jié)核細(xì)菌檢測(cè)中運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)法的臨床價(jià)值

溫曉萍

【摘要】目的：分析在肺結(jié)核細(xì)菌檢測(cè)中運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)法的臨床價(jià)值。方法：本文總共納入88例觀察對(duì)象，均是我院2016年5月—2021年5月收治的疑似塵肺合并肺結(jié)核患者，對(duì)88例患者開(kāi)展熒光定量PCR與痰涂片抗酸染色檢測(cè)。將臨床診斷作為參照依據(jù)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果：在檢出率、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值上，熒光定量PCR明顯高于痰涂片抗酸染色檢測(cè)（P<0.05）。結(jié)論：熒光定量PCR檢測(cè)法用于肺結(jié)核細(xì)菌檢測(cè)的效果顯著，臨床可進(jìn)一步推廣運(yùn)用。

【關(guān)鍵詞】肺結(jié)核；細(xì)菌檢測(cè)；熒光定量PCR檢測(cè)法；臨床價(jià)值

Clinical value of fluorescence quantitative PCR detection method in the detection of pulmonary tuberculosis bacteria

WEN Xiaoping

Department of Laboratory， Huizhou Occupational Disease Prevention and Control Hospital， Huizhou， Guangdong 516001， China

【Abstract】Objective： To analyze the clinical value of fluorescent quantitative PCR detection method in the detection of pulmonary tuberculosis bacteria. Methods： A total of 88 observation objects were included in this study， all of whom were patients with suspected pneumoconiosis complicated with pulmonary tuberculosis admitted to our hospital from May 2016 to May 2021. Fluorescence quantitative PCR and sputum smear acid-fast staining were performed on 88 patients. The clinical diagnosis was used as a reference to compare the test results of the two methods. Results： The detection rate， sensitivity， specificity， positive predictive value and negative predictive value of fluorescence quantitative PCR were significantly higher than those of sputum smear acid-fast staining（P<0.05）. Conclusion： Fluorescence quantitative PCR detection method has a remarkable effect in the detection of pulmonarytuberculosis bacteria， and it can be further promoted and applied in clinical practice.

【Key？Words】Pulmonary tuberculosis； Bacterial detection； Fluorescence quantitative PCR detection method； Clinical value

肺結(jié)核在臨床上比較常見(jiàn)，是一種慢性的傳染病，患者在感染結(jié)核桿菌后不一定及時(shí)出現(xiàn)癥狀，當(dāng)患者的抵抗力降低情況下才會(huì)引起疾病[1]。肺結(jié)核好發(fā)于5～35歲群體，該疾病可以侵及人體許多臟器，其中以肺部受累形成多發(fā)肺結(jié)核最為常見(jiàn)。近些年來(lái)，肺結(jié)核的患病人數(shù)不斷增加，達(dá)到了500萬(wàn)，在全球各國(guó)的排名中位居第二，且呈逐年升高的趨勢(shì)[2]。因此，早期診斷和治療肺結(jié)核是非常重要的，可有效改善患者的預(yù)后。由于肺結(jié)核缺乏特異性，在臨床診斷過(guò)程中容易與其他肺部疾病相混淆，出現(xiàn)漏診和誤診的概率比較高，幫助患者選擇合適的檢測(cè)方法是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。有學(xué)者在研究提出，熒光定量PCR用于肺結(jié)核檢測(cè)后，具有較高的檢出率[3]。鑒于此，本文將88例疑似肺結(jié)核患者為例進(jìn)行分析，試探討熒光定量PCR檢測(cè)法的效果，以期為后續(xù)治療提供依據(jù)，具體報(bào)告內(nèi)容請(qǐng)看下文。

1 資料與方法

1.1 一般資料

觀察例數(shù)有88例，觀察時(shí)間在2016年5月—2021年5月，觀察對(duì)象是我院收治的疑似塵肺合并肺結(jié)核患者，其中男患者49例，女患者39例，年齡20～62歲，平均年齡（41.52±3.46）歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者年齡在20歲及以上，職業(yè)性塵肺??；②患者的精神正常，可以與醫(yī)護(hù)人員進(jìn)行簡(jiǎn)單交流；③患者的病歷資料齊全；④患者年齡>18歲；⑤本次研究得到倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且患者及家屬知情并配合研究。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者在入組前確診為肺結(jié)核；②患者的精神異常或存在認(rèn)知障礙，不能配合完成檢測(cè)；③女性患者處于妊娠期或哺乳期；④患者不愿意參加研究或中途退出研究。

1.2 方法

88例患者均開(kāi)展熒光定量RCP與痰涂片抗酸染色法檢查，詳細(xì)方法為：（1）熒光定量PCR檢測(cè)：①標(biāo)本收集：收集患者晨起時(shí)的痰液作為檢測(cè)標(biāo)本，首先利用雙氧水清潔口腔，防止干擾檢測(cè)結(jié)果；隨后叮囑患者用力深咳后，取第二次咳嗽的痰液，將痰液放入無(wú)菌器皿中送檢。②熒光定量PCR檢查過(guò)程：利用無(wú)菌吸管抽取1mL痰液中的膿性或黏稠標(biāo)本，根據(jù)2：1的比例向試管中加入痰標(biāo)本處理液，封閉試管后連續(xù)震蕩5min，隨后在室溫環(huán)境下靜置15min，確保痰標(biāo)本能夠完全液化。完成標(biāo)本處理工作后，利用廈門(mén)至善生物科技股份有限公司提供的熒光定量PCR儀（型號(hào)：SLAN？-96S）及配套試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。（2）痰涂片抗酸染色法：①標(biāo)本采集：需要連續(xù)3d以上采集患者的痰液，痰液必須是患者清晨晨起深呼吸后咳出的痰液?；颊咴谇宄科鸫埠?，立即采用清水漱口，隨后深呼吸后進(jìn)行咳痰，咳出的痰液即為標(biāo)本；夜間痰應(yīng)該是送痰前一天晚上咳出的痰液，隨后利用痰涂片法抗酸染色法檢驗(yàn)痰液中的結(jié)核分枝桿菌。②痰涂片抗酸染色法的操作過(guò)程：固定好患者的痰標(biāo)本后進(jìn)行酒精燈加熱處理，之后將樣本放置到玻片上，并將抗酸染色劑滴注在玻片上進(jìn)行染色，染色時(shí)間控制在30min，隨后利用流動(dòng)的自來(lái)水沖洗標(biāo)本，之后再次滴入染色劑，染色1min后再次利用流動(dòng)自來(lái)水沖洗，并在室溫環(huán)境下自然風(fēng)干。將風(fēng)干的標(biāo)本放入顯微鏡下方進(jìn)行觀察，首先利用低倍顯微鏡進(jìn)行篩查，然后利用高倍顯微鏡確認(rèn)結(jié)果。

1.3 觀察指標(biāo)

將臨床診斷作為參照標(biāo)準(zhǔn)，88例患者經(jīng)臨床診斷發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性有69例，陰性有19例，比較熒光定量PCR與痰涂片抗酸染色法的檢測(cè)結(jié)果，仔細(xì)記錄檢出率、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用（χ±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 分析痰涂片抗酸染色法的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)痰涂片抗酸染色法檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)真陽(yáng)57例，真陰12例，總共檢查出69例，診斷檢出率為78.41%（69/88），見(jiàn)表1。

2.2 觀察熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)真陽(yáng)64例，真陰17例，總共檢查出81例，診斷檢出率為92.05%（81/88），見(jiàn)表2。

2.3 比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的差異

在檢出率、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值上，熒光定量PCR明顯高于痰涂片抗酸染色法（P<0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

肺結(jié)核是臨床常見(jiàn)的結(jié)核病，具有較高的發(fā)病率與死亡率，給患者的身體健康構(gòu)成極大的威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，全球每年發(fā)生肺結(jié)核的人數(shù)達(dá)到800～1000萬(wàn)，同時(shí)也是死亡率最高的單一傳染病；我國(guó)結(jié)核桿菌感染患者占了總?cè)藬?shù)的1/3，其中肺結(jié)核患者有500萬(wàn)，在全球各國(guó)的排名中居于第二；在我國(guó)每年因肺結(jié)核死亡的人數(shù)有300萬(wàn)，占非自然死亡的70.0%，占傳染疾病患者總數(shù)的10.0%?；颊吒腥窘Y(jié)核桿菌后，容易出現(xiàn)咳嗽、氣短、胸悶等癥狀，若是沒(méi)有及時(shí)進(jìn)行有效處理，一旦擴(kuò)散會(huì)給公共安全、患者身心健康帶來(lái)不良影響。因此，盡早篩查和積極治療肺結(jié)核是非常有必要的，對(duì)于早期確診和治療肺結(jié)核、改善患者的預(yù)后具有重要意義。

隨著生化技術(shù)的發(fā)展與完善，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段引起了臨床的關(guān)注與重視，已成為各類疾病診斷的常用手段。痰涂片抗酸染色法是臨床檢測(cè)肺結(jié)核的常用手段，具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，其操作過(guò)程的穩(wěn)定性與均一性較好，在密封儀器內(nèi)完成切片、脫蠟、烘烤以及染色等步驟，減少了外界環(huán)境雜質(zhì)的污染，提高了檢出率。但是，痰涂片抗酸染色法對(duì)于已經(jīng)滲出的病變類型、典型結(jié)核結(jié)節(jié)的檢測(cè)存在一定的難度，再加上該方法的敏感度與特異度較低，提高了疾病漏診和誤診的概率，限制了臨床應(yīng)用范圍。此外，由于肺外結(jié)核病患者痰液中的結(jié)核分枝桿菌的含量比較少，利用痰涂片抗酸染色法檢測(cè)后的效果也不理想，容易發(fā)生漏診和誤診情況。熒光定量PCR是近些年來(lái)新興的檢測(cè)手段，其在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，通過(guò)熒光化學(xué)物質(zhì)來(lái)測(cè)定每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后形成產(chǎn)物的總量，提高疾病診斷的準(zhǔn)確度。熒光定量PCR是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的，其在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個(gè)熒光標(biāo)記探針，激發(fā)的熒光信號(hào)值與所擴(kuò)增的目標(biāo)基因數(shù)量呈正比，通過(guò)對(duì)試管內(nèi)熒光值的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，來(lái)實(shí)現(xiàn)木板的定量檢測(cè)。當(dāng)熒光定量PCR用于結(jié)核病檢測(cè)時(shí)，其主要利用結(jié)核分枝桿菌的特異性和結(jié)核分枝桿菌特異性的熒光反應(yīng)來(lái)判定結(jié)核桿菌的性質(zhì)，具有較高的檢測(cè)靈敏度；同時(shí)，熒光定量PCR通過(guò)PCR反應(yīng)液與耐熱DNA聚合酶的變化，結(jié)合4種核苷酸單體來(lái)診斷疾病。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在檢出率、敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值以及陰性預(yù)測(cè)值上，熒光定量PCR明顯高于痰涂片抗酸染色法（P<0.05），表明相較于痰涂片抗酸染色法，熒光定量PCR的檢測(cè)效果更佳，敏感度以及特異度更高，有利于提高疾病診斷的準(zhǔn)確率。追其原因是：相較于痰涂片抗酸染色法，熒光定量PCR技術(shù)的操作比較簡(jiǎn)單，檢測(cè)速度比較快，具有很高的敏感度和特異度，有效提高了疾病檢測(cè)的檢出率，為肺結(jié)核的診斷和治療提供了科學(xué)依據(jù)。

綜上所述，熒光定量PCR用于肺結(jié)核的檢測(cè)效果理想，具有較高的檢出率、敏感度和特異度，可作為肺結(jié)核的輔助檢測(cè)手段，有利于臨床醫(yī)師了解患者的病情，為后續(xù)治療方案的制定提供依據(jù)，具有較高的臨床推廣價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1] 時(shí)廣利，馬尚，尹顏軍，等.肺結(jié)核患者血清中miRNA-16和miRNA-155檢測(cè)的臨床意義[J].臨床肺科雜志，2019， 24（8）：1450-1454.

[2] 李艷紅，李春艷，陳天芳，等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR與痰涂片抗酸染色法診斷結(jié)核病的靈敏度，特異度比較[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐，2019，4（30）：134-136.

[3] 孫林雍，嚴(yán)嘉琦，陳昶，等.熒光定量PCR與抗酸特殊染色對(duì)疑似骨關(guān)節(jié)結(jié)核中結(jié)核分枝桿菌的檢測(cè)對(duì)比[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2020，36（9）：101-103.

[4] 郝穎華，羅森源，湯顯斌.即時(shí)熒光定量PCR法對(duì)石蠟包埋組織中結(jié)核桿菌的檢測(cè)價(jià)值探究[J].中華病理學(xué)雜志，2020，49（10）：1068-1070.

[5] 張睿.熒光定量PCR法檢測(cè)肺結(jié)核患者痰液中結(jié)核分枝桿菌DNA的診斷價(jià)值分析[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)，2019，29（32）：325-326.

[6] 李觀華，方筱，鄧?yán)?，?熒光定量PCR法聯(lián)合傳統(tǒng)方法在結(jié)核桿菌檢測(cè)中的應(yīng)用[J].當(dāng)代醫(yī)學(xué)，2020， 26（21）：59-61.

[7] 袁瑛，明湘虹，鄭宏，等.SAT技術(shù)與熒光定量PCR在痰涂片陰性肺結(jié)核診斷中的價(jià)值研究[J].臨床肺科雜志，2019，24（3）：160-162.

[8] 宋華峰，趙靜，胥萍.熒光定量PCR在結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2019，19（11）：20-23.

[9] 謝景齊，周嬌紅.熒光定量PCR法用于診斷肺結(jié)核患者痰液中結(jié)核分枝桿菌DNA的臨床價(jià)值[J].中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥，2019，26（12）：150-152，155.

[10] 步曉琳，李寶華，連愛(ài)瓊，等.抗酸染色與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)在肺結(jié)核輔助診斷中的應(yīng)用效果對(duì)比[J].中國(guó)醫(yī)療器械信息，2020，26（22）：25-26，94.