棉花抗黃萎病遺傳學研究進展

李廷剛，鞏東營，張倩倩

（1山東省葡萄研究院，濟南 250100；2山東省農業科學院農產品研究所，濟南 250100）

0 引言

黃萎病是棉花生長過程中的主要病害影響棉花產量提高和品質提升，嚴重發生時甚至可造成絕產，因此又被稱為棉花的“癌癥”[1]。棉花黃萎病是一種典型的土傳真菌病害，在中國主要由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)侵染所致。由于中國棉花種植結構單一、棉田連作、加之棉花種子異地調運等原因，導致黃萎病在中國各大棉區均有危害發生[2]。大麗輪枝菌變異速度快，加之棉花抗性資源匱乏，因此棉花黃萎病防治極為困難。目前選育棉花優異抗黃萎病品種是解決這一困境最為經濟有效的策略，這就要求首先探索棉花抗黃萎病遺傳規律，進而開展抗性QTL 定位研究，最終挖掘優異抗病基因，從而為棉花抗黃萎病遺傳育種奠定基礎[3]。目前，不少學者在棉花黃萎病抗性遺傳規律、抗性QTL定位以及抗病基因挖掘等方面開展了研究，初步探索了棉花黃萎病的抗性遺傳規律、定位了350多個抗性QTL、鑒定了50 多個抗病基因，但是仍存在棉花黃萎病抗性遺傳規律不確定、抗性QTL應用性差以及抗病基因資源不足的現狀[4]。棉花栽培主要以陸地棉和海島棉為主，通常認為海島棉是黃萎病抗性的主要來源，但也有優異抗黃萎病陸地棉種質資源的報道[5]。本研究分別對海島棉和陸地棉抗黃萎病遺傳規律、抗性QTL定位以及抗病基因挖掘現狀等進行了歸納總結，以期為棉花抗黃萎病育種提供理論依據。

1 棉花黃萎病抗性遺傳規律研究

Plank等[6]于1963年首次提出了抗性理論，包括垂直抗性和水平抗性兩種。垂直抗性理論是指抗病基因與病原菌不同生理小種間的抗性關系是一一對應的，寄主植物對病原菌的抗病性一般由主效單基因所控制，表現為質量性狀遺傳。水平抗性理論則是指抗病基因與病原菌之間是一對多的關系，一個抗病基因可以對病原菌多個生理小種產生抗性，寄主植物對病原菌的抗病性通常由多個微效基因所控制，表現為數量性狀遺傳。數量性狀遺傳群體的抗性表型多呈現出連續的正態分布趨勢，但是表型鑒定比較容易受到外界環境因素等的影響，但是當多個微效基因共同起作用時，也可以表現出主效基因的抗性表現，并且抗性更加穩定[7]。因此，質量性狀遺傳與數量性狀遺傳之間并沒有清晰的界限[8]。Fahmy等于1931年首次報道了棉花抗黃萎病遺傳方式的研究，迄今中國科研工作者也對該問題開展了多次探索，但由于試驗品系、接種菌系和鑒定標準誤差等原因，目前對該科研問題仍未獲得確切一致的結論。

1.1 海島棉黃萎病抗性遺傳規律研究

質量性狀通常由主效基因控制，主效基因控制的抗病性為顯性，感病性為隱形。此外，抗性的顯隱性還受品種的遺傳背景、鑒定菌系和環境因素等的影響。Bell等[9]以海島棉和陸地棉作為親本材料，通過雜交獲得7個不同組合群體，組合群體抗性鑒定結果顯示，其中2個群體表現為部分顯性遺傳特性，5個群體表現為完全顯性遺傳特性，7 個組合均表現為質量性狀遺傳模式。馬峙英等[10]以海島棉作為親本材料，構建了四世代和六世代遺傳群體，分別使用強、弱不同致病力菌系對遺傳群體進行抗病性鑒定，抗性鑒定結果顯示，黃萎病抗性受單基因控制、顯性模式，呈現質量性狀遺傳特性。房衛平等[11]以海島棉和陸地棉作為親本材料，通過雜交構建了4 個遺傳群體，使用中等致病力菌系對遺傳群體進行抗病性鑒定，抗性鑒定結果顯示，黃萎病抗性同樣受單基因控制、顯性模式，同樣呈現質量性狀遺傳特性。王省芬等[12]、蔡應繁等[13]也報道了與上述相似的研究結果。綜合已報道研究結果表明，海島棉黃萎病抗性主要受單個基因控制，多表現為質量性狀遺傳特性。

1.2 陸地棉黃萎病抗性遺傳規律研究

與質量性狀遺傳不同，數量性狀遺傳由多個微效基因共同控制，多個微效基因間具有加性效應和非加性效應，其中加性效應是數量性狀遺傳的主要方式。已有研究報道顯示，陸地棉黃萎病抗性遺傳規律同時存在質量性狀遺傳和數量性狀遺傳的特征。首先，Barrow[14]以陸地棉‘Acala9519’和‘Acala227’作為親本材料構建遺傳群體，在溫室中利用ss-4 菌系對遺傳群體進行抗病性鑒定，抗、感分離比符合3:1 的比例，因此認為在陸地棉中黃萎病抗性符合質量性狀遺傳特性。蔡應繁等[14]利用多個陸地棉品種/系構建遺傳群體，利用以上遺傳群體開展黃萎病抗性遺傳模式研究，結果顯示，‘中棉所12’、‘Mo-3’的黃萎病抗性受1 對顯性基因控制，而‘川2802’的黃萎病抗性受2 對顯性基因控制。Wilhelm 等[15]、潘家駒等[16]研究結果也顯示，陸地棉黃萎病抗性受主效基因所控制。因此認為，陸地棉中抗黃萎病遺傳符合質量形狀遺傳特性。其次，Verhalen 等[17]以不同抗病性陸地棉為親本構建雙列雜交群體，群體抗病性鑒定結果顯示，陸地棉黃萎病抗性由多個微效基因共同控制，加性效應遺傳顯著，符合數量性狀遺傳特性。王升正等[18]以陸地棉‘中植棉KV-3’和‘KV9-1 品系’為親本構建了六世代遺傳群體，群體抗病性鑒定結果顯示，陸地棉黃萎病抗性受2對基因控制，且加性遺傳效應顯著，同樣符合數量性狀遺傳的特性。此外，梁亞軍等[7]等、Devey等[19]、王振山等[20]、校百才等[21]、韓祥銘等[22]、王紅梅等[23]學者的研究報道也認為，陸地棉黃萎病抗性符合數量性狀遺傳的特性，同時加性遺傳效應起主導作用。

對陸地棉而言，抗性遺傳的方式較為復雜，通常溫室單一菌系接種進行抗性鑒定，多傾向于抗性為質量性狀遺傳。而田間病圃進行抗性鑒定時，多傾向于抗性為數量性狀遺傳，且以加性效應為主。綜合以上研究報道，認為陸地棉抗性遺傳可能受親本材料選擇、鑒定病菌類型、鑒定條件差異和病害分級標準等因素影響較大。

2 棉花黃萎病抗性QTL定位研究

QTL定位主要基于標記間連鎖發生進行，其基本原理是將分子標記與表型性狀進行連鎖，基于不同統計處理模型，將標記錨定到基因組的相應位置上，同時計算QTL的遺傳效應[24]。目前，棉花遺傳連鎖圖譜構建多使用SSR、RAPD、SRAP 和AFLP 等分子標記，這些分子標記因其操作簡便、快捷、費用低等特點而倍受青睞，其中應用最多的是SSR 標記，房衛平等[25]、Zhu等[26]和杜威世等[27]分別利用RAPD、AFLP 和SSR 標記開展了棉花抗黃萎病QTL定位研究。

2.1 海島棉抗黃萎病QTL定位研究

陸地棉是目前的主栽棉花品種，具有廣適性特征，海島棉作為僅次于陸地棉的第二大棉花栽培品種，具有優質的遺傳基礎。陸、海品種間雜交相較于種內雜交具有較高的遺傳多樣性，為了提高遺傳圖譜的密度和覆蓋度，很多棉花抗黃萎病QTL 定位研究利用陸、海種間雜交構建遺傳群體來開展。杜威世等[27]以‘海島棉II15-3493’和‘陸地棉石-875’作為親本構建遺傳群體，通過定位獲得1 個抗黃萎病主效QTL，可解釋50.1%的表型變異。高玉千等[28]以海島棉‘Pima-90’和陸地棉‘邯鄲-208’作為親本構建遺傳群體，通過定位獲得了3 個抗黃萎病主效QTLs，分別可以解釋15.39%、54.11%和57.18%的表型變異。Bolek 等[29]以海島棉‘Pima-S7’和陸地棉‘Acala-44’作為親本構建了F2群體，基于該群體繪制了包含35 個標記覆蓋531 cM的遺傳連鎖圖譜，通過定位獲得15個抗黃萎病QTLs，3 個為主效QTLs，其中cM12和STS1位于LG-1連鎖群BNL3147-2位于LG-2 連鎖群，由于LG-1 與LG-2連鎖群都位于D基因組11號染色體上，推測該染色體為提供黃萎病抗性的主要染色體。Shi 等[30]以海島棉‘Hai1 品系’和陸地棉‘CCRI36 品系’作為親本構建了BC1F1，BC1S1和BC2F1群體，基于該群體繪制了包含2292個標記覆蓋5115.16 cM的遺傳連鎖圖譜，通過定位獲得48 個抗黃萎病QTLs，A、D 基因組分別包含33 和15 個QTLs，其中6 個為已報道QTLs，42 個為首次發現QTLs。另外，昝偉等[31]、吳翠翠等[32]分別構建F2:3家系和永久F2群體，通過定位分別獲得2和19個抗性QTLs。目前，已報道的海島棉黃萎病抗性QTLs 已將近150個。

2.2 陸地棉抗黃萎病QTL定位研究

已有不少研究發現，棉花陸、海雜交后構建群體雖具有較高的遺傳多樣性，但較易出現性狀分離的現象，因此，基于陸地棉優異抗性種質資源開展抗黃萎病QTL 定位研究也在不斷展開。Palanga 等[33]以陸地棉作為親本構建了RILs遺傳群體，對該群體分別進行溫室和田間的抗病性鑒定，基于抗性表型開展抗黃萎病QTL 定位，其中62 個QTLs 與病情指數相關，可解釋3.7%～12.2%的表型變異；57個QTLs與發病率相關，可解釋2.3%～21.30%的表型變異；共獲得119 個QTLs，且所有QTLs 呈現簇狀分布的特征，在基因組上可聚集為18 個QTL 簇。葛海燕等[34]同樣以陸地棉作為親本構建遺傳群體，通過定位獲得1個抗黃萎病QTL，該QTL 位于9 號染色體上，可解釋13.8%的表型變異。Yang 等[35]以陸地棉‘5026’和‘李-8’作為親本材料，構建了RIL遺傳群體，基于該群體繪制了覆蓋760.88cM的遺傳連鎖圖譜，于苗期和成株期分別定位獲得3 個和4 個QTLs，可解釋6.39%～33.22%的表型變異。此外，李磊[36]、蔣鋒等[37]、王紅梅等[23]、王沛政[38]通過構建遺傳群體，分別定位得到了3、3、8和41個黃萎病抗性QTLs。目前，已報道的陸地棉黃萎病抗性QTLs 共計已有200多個。

3 棉花黃萎病抗病基因研究

植物抗病基因的挖掘與抗病基因機理解析研究已有較長的時間，目前，已在水稻、玉米、小麥等多種作物中取得了顯著的成果，根據抗病基因的結構域分布情況，可將抗病基因分為五大類，NBS-LRR類：包含N端螺旋卷曲結構域或Toll蛋白及白細胞介素-1受體結構域[39-40]，中間NB-ARC 結構域和C 端LRRs 結構域；LRR-TM 類：包含N 端胞外LRRs 和C 端TM 結構域；STK 類：包含STK 結構域和十四酰化位點；LRR-TMSTK 類：包含N 端LRRs 結 構域，TM 結構域 和C 端STK結構域；TM-CC類：包含TM結構域和胞內CC結構域[41]。伴隨著分子生物學技術高通量測序技術的不斷發展與更新，為廣大科研工作者提供了更高質量的棉花基因組和更快捷的基因挖掘方案。目前，棉花中克隆的抗黃萎病基因已有幾十個之多，雖取得了一定的成績，但還遠不足以克服黃萎病的危害，現對已克隆的棉花抗黃萎病基因進行歸納總結。

3.1 NBS-LRR類抗黃萎病基因

目前已挖掘的抗病基因中，NBS-LRR類抗病基因是其中最大的一類，也是研究的最為深入透徹的一類，在棉花中也有發現該類抗黃萎病基因的報道。Yang等[42]基于cDNA 文庫篩選得到候選基因片段，采用RACE 策略克隆得到GbRVd基因，該基因為典型的CC-NBS-LRR類抗病基因；表達模式分析顯示，GbRVd基因在棉花多個組織中均有表達，但以在葉片中表達量最高；GbRVd基因在大麗輪枝菌脅迫條件下能夠顯著上調表達，48 h 表達量達到最高；VIGS 沉默GbRVd基因后，棉花沉默株系中SA、NO 和H2O2的產生量顯著降低，從而導致棉花沉默株系對大麗輪枝菌抗病性顯著降低。Li等[43]基于海島棉自然群體通過定位獲得1 個主效抗性位點VdRL08，位點解析后發現，該位點范圍內存在8 個NBS-LRR 基因，VIGS 分別沉默位點內候選基因，發現GbaNA1基因沉默株系對大麗輪枝菌抗性顯著降低，同時GbaNA1基因在擬南芥中過量表達能夠提高擬南芥對大麗輪枝菌的抗性水平；GbaNA1基因不同棉花品種多態性分析顯示，在感病品種中該基因單堿基的缺失導致了提前的截短，從而導致喪失了黃萎病抗性；此外，還發現GbaNA1基因行使抗病功能不依賴Ave1識別途徑。

3.2 STK類抗黃萎病基因

STK 類抗病基因介導抗病功能主要通過磷酸化介導抗病信號的級聯放大，最終激活下游功能基因，從而抵御病原菌的侵染，達到抗病的功能。目前，STK類抗病基因的研究主要集中在模式植物擬南芥中，棉花中該類抗病基因的研究還相對滯后。Zhang等[44]在海島棉‘Pima90-53’中克隆了1 個STK 類抗病基因GbSTK，該基因可被大麗輪枝菌誘導顯著上調表達；擬南芥GbSTK基因過表達株系可誘導PR4、PR5和EREBP等抗病相關基因表達，同時提升活性氧清除能力，從而介導對大麗輪枝菌的抗病性。Zhao等[45]在海島棉‘H7124’中克隆了1 個STK 類抗病基因GbRLK；將該基因在棉花和擬南芥中過表達，顯著提高過表達株系的黃萎病抗性水平；轉錄組分析顯示，GbRLK基因主要調控脅迫通路上相關基因，因此認為GbRLK基因主要通過減少水分損耗來賦予寄主黃萎病抗性。Gao等[46]在陸地棉‘CA4002’品系中克隆了1個STK類抗病基因GhBAK1，在CA4002 品系中VIGS 沉默GhBAK1基因后可誘導程序性細胞死亡和ROS 爆發，從而導致VIGS沉默株系黃萎病抗性水平顯著降低。

3.3 LRR-TM類抗黃萎病基因

目前研究最為清晰的LRR-TM 類抗病基因為番茄中抗黃萎病基因Ve1[47]，在棉花中LRR-TM類抗病基因的研究多是基于Ve基因的同源克隆展開。Chen等[48]在海島棉‘H7124’中克隆了1 個Ve同源基因Gbvdr3，該基因VIGS 沉默株系對大麗輪枝菌抗性水平顯著降低；Gbvdr3基因在擬南芥中過表達可誘導PR1、PR3、PR5、PDF1.2和GST2等抗病相關基因的表達，同時激活活性氧的爆發和胼胝質的沉積，從而介導擬南芥過表達株系黃萎病抗性。Chen 等[49]在海島棉‘H7124’中克隆2 個Ve同源基因GbaVd1和GbaVd2，分別將以上2個基因在棉花中VIGS沉默后，均導致沉默株系對大麗輪枝菌的抗性降低；GbaVd1和GbaVd2基因擬南芥過表達株系與擬南芥野生型轉錄組比對分析顯示，GbaVd1和GbaVd2基因主要通過激活細胞胞吞作用、抗病信號轉導以及細胞壁增厚等過程介導擬南芥對大麗輪枝菌的抗病性。此外，Zhang 等[50]、Zhang 等[51]分別在海島棉中克隆了Ve同源基因基因GbVe和Gbve1，以上2 個基因在大麗輪枝菌脅迫條件下可被顯著誘導表達，在擬南芥中過表達均能夠顯著提高對大麗輪枝菌的抗性水平。

目前已發現的棉花抗黃萎病基因除了以上3類以外，還有多個其他類型的抗黃萎病基因被挖掘和報道。比如，Mo 等[52]鑒定、克隆了1 個多胺氧化酶基因GhPAO，該基因可誘導精胺(Spm)高水平表達，Spm 則激活蛋白激酶和細胞色素P450的表達促進抗毒素的積累，從而提高寄主對大麗輪枝菌的抗性水平。Gao等[53]鑒定、克隆了1個棉酚合成關鍵基因GbCAD1和1個水楊酸調控關鍵基因GbSSI2，以上2 個基因均可提高棉花對大麗輪枝菌的抗性水平。Li 等[54]鑒定、克隆了一個硫氧還蛋白GbNRX1，GbNRX1基因在原生質體中可通過ROS 累積從而抵御大麗輪枝菌的侵染。此外，已報道的棉花抗黃萎病基因還包括GbTLP1、GbSTB1、GhHb1、GhSKIP35、GhPGIP1、GhDHS1、GaRPL18、GhNDR1等[55-62]，這些基因大多編碼功能性酶類或者受體蛋白類，通過SA或者JA/ET途徑介導其黃萎病抗性功能。

4 問題及展望

近年來，中國棉花黃萎病的發生呈現出逐年加重的趨勢，有必要引起足夠的重視。主要存在的問題有3個：第一，雖然對棉花黃萎病抗性遺傳規律的研究已有較長的歷史，但以往對于棉花黃萎病抗性遺傳規律的探究多基于單一分離群體在某一特定時期的抗性表現展開，因此不能反映出棉花整個生育期的抗性情況，且可重復性差，導致目前仍無明確、一致的結論。第二，目前雖已定位到了多個棉花黃萎病抗性QTL，但是由于橋梁標記少，很多抗性QTL不能定位到棉花基因組上，應用性較差，尚不能滿足實際育種的需求。第三，中國棉花種質資源大約有5000 份，植棉區主要以種植陸地棉為主，但陸地棉中高抗黃萎病資源匱乏，并且抗性穩定性較差，加之大麗輪枝菌變異速度快，導致陸地棉優異抗性資源不斷消失，嚴重制約棉花抗黃萎病遺傳改良工作的不斷發展。

基于目前的研究現狀，提出一下3 點建議：第一，為了獲取優異的抗性種質資源，有必要挖掘優異的野生種進行馴化，或通過多種誘變手段創制新種質，或通過分子生物學技術和方法培育優異抗性品系。第二，有必要在開展棉花黃萎病抗性遺傳規律研究時構建多樣化、高多態性的遺傳群體，同時采用更為適宜的抗性鑒定方法、寄主材料以及病原菌菌系等。第三，伴隨著分子生物學技術的不斷發展，分子標記輔助選擇育種可以極大的提高定位精準度，縮短育種年限，同時還能克服棉花不同品種種間遠源雜交不親和的瓶頸，因此可以將分子標記輔助選擇育種技術最大程度的應用于棉花抗黃萎病育種過程中，從而更好的滿足棉花抗黃萎病遺傳育種的現實需求和克服育種技術壁壘，加快育種進程。

目前，棉花抗黃萎病育種已經取得了顯著的成果，相信持續創制優異抗性種質資源，深入揭示棉花抗黃萎病的遺傳規律，伴隨生物學技術的不斷發展不斷探索優化育種方法，必然會極大推動棉花抗黃萎病研究取得實質性的進展，最大限度降低黃萎病對棉花生產所造成的危害。