自噬與復發性流產關系的研究進展

孫佳寧，馮曉玲，趙小萱，李波

(1.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院婦科，哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫藥大學附屬第三醫院康復科，哈爾濱 150030)

近年復發性流產(recurrent spontaneous abortion，RSA)發病率呈上升趨勢，為1%～5%[1]。RSA的病因通常包括染色體異常、母體解剖結構異常、子宮內膜感染、內分泌失調和免疫缺陷，但其潛在機制及部分RSA的病因仍不清楚。因此，尋找病因成為RSA防治的難點和關鍵點。據歐洲人類生殖與胚胎學會指南報道，在沒有明確妊娠失敗原因而試圖生育的夫婦中，不明原因復發性流產(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)的患病率高達50%～75%[2]。目前尚無明確的改善RSA病因不明患者妊娠結局的有效方法。RSA逐漸成為較難治療的女性生殖障礙性疾病之一，可能引起不良妊娠結局，造成患者心理壓力增加，嚴重威脅家庭和社會的和諧穩定。

自噬分為微吞噬、巨自噬和伴侶介導的自噬，其中巨自噬以形成雙膜結構的自噬體為特征，其對細胞內降解的影響最大，也是研究最廣泛和最深入的自噬形式。目前，自噬主要是適應性免疫的效應器和調節器，當細胞處于缺氧、營養缺乏、內質網應激、線粒體損傷、免疫信號或炎癥刺激時，機體通過各種信號途徑誘導自噬發生，以維持細胞正常代謝[3-4]。2016年，Yoshinori Ohsumi因對自噬機制的詳細闡明而獲得諾貝爾醫學家獎，隨后各學科學者們展開了自噬的相關研究。自噬失調存在于多種疾病中，包括惡性腫瘤、退行性疾病、傳染病、心肌病、肥胖癥、自身免疫性疾病等[5]。但目前鮮有自噬與RSA相關的文獻報道，而自噬參與RSA發生發展的相關機制是研究RSA的新方向。現就自噬與RSA關系的研究進展予以綜述。

1 自噬的概述

1.1自噬的概念 “自噬”一詞最早源于希臘語，由諾貝爾生理學獲獎者Christian de Duve在一次溶酶體研討會上首次提出，翻譯過來意為“自己吃掉自己”。1992年，日本學者Yoshinori Ohsumi在研究酵母時發現了自噬相關的分子機制。隨后，自噬相關基因統一命名為ATG(autophagy-related gene)。1998年，美國學者Beth Levine等首次成功克隆出哺乳動物ATG，并將其命名為Beclin-1[6]。此后，自噬現象在生物醫學界的影響力不斷擴大，相關研究飛速發展。

1.2自噬的分型及功能 自噬是存在于真核細胞中的高度保守的生物學行為，通常指巨自噬，其對細胞內降解具有重要影響[7]，也是一種與妊娠相關疾病聯系最密切的自噬機制。自噬體和溶酶體的融合后發生降解，導致氨基酸、核苷、脂肪酸和糖釋放。許多ATG參與自噬的發生過程[8-9]。在這些基因中，ATG5主要參與自噬前體膜的延長和閉合，ATG和微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)又稱MAP1LC3，主要參與自噬體的發育和成熟，對吞噬細胞延長和最終自噬體形成方面具有重要作用。

自噬是一種程序化的細胞內自我降解過程，為保持細胞內蛋白質的平衡和內環境的穩態，細胞利用溶酶體通過自噬降解錯誤折疊或聚集的蛋白質、清除細胞內病原體和受損的細胞器，如線粒體、內質網和過氧化物酶體。除清除細胞內聚集體和受損的細胞器外，自噬還能促進細胞衰老和細胞表面抗原呈遞，防止基因組不穩定和壞死[10]，可見，自噬對細胞內穩態和生物能量管理具有重要意義。

1.3自噬的發生過程 自噬的發生過程主要包括形成自噬體、自噬體與溶酶體融合和降解三個步驟[11]。自噬的發生可由多種反應引起，如應激、缺氧損傷、亞細胞器損傷和蛋白質聚集。所有的自噬調節因子中，哺乳動物雷帕霉素復合物1靶點被認為在自噬的發生過程中起關鍵作用，是自噬起始的調控分子，同時負調控哺乳動物雷帕霉素復合物1有助于自噬的發生。當機體處于能量匱乏、線粒體損傷等誘導刺激下，哺乳動物雷帕霉素復合物1失活，導致哺乳動物絲/蘇氨酸激酶1激活，進而將哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)從細胞質轉移到內質網中，誘導自噬體的起始。自噬體完成核化后，通過ATG12與ATG5結合系統、ATG8脂化系統完成下一步自噬延伸。ATG12-ATG5-ATG16L1復合物被募集到自噬體膜上，促進磷脂酰乙醇胺與LC3發揮脂化作用。LC3Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合生成LC3Ⅱ，隨后LC3Ⅱ與細胞膜結合，能夠促進自噬體的形成[12]。LC3Ⅱ是成熟自噬體的結構成分，故常作為自噬的特異性標志物。自噬泡成熟后與溶酶體進一步融合形成自噬溶酶體，進而自噬體內的待降解物被降解和再循環[13]。

2 自噬與RSA

近年來，自噬與婦科疾病的關系備受關注，子宮內膜細胞存在自噬現象。自噬在子宮內膜相關生理和病理生理過程中發揮不可或缺的作用，包括月經周期、正常妊娠期時蛻膜化過程。自噬失調是多種子宮內膜相關疾病發病機制的基礎，如子宮內膜異位癥、子宮內膜癌和不孕癥[14-15]。隨著研究的深入發現，細胞自噬在RSA的病理生理機制中發揮重要作用。

2.1自噬異常與RSA蛻膜細胞 孕期的自噬調節涉及胚胎、母體和母胎相互作用三方面，自噬過程可發生于蛻膜和滋養層細胞中。胚胎著床是哺乳動物繁殖過程中一個重要而復雜的過程，隨著胚胎黏附、侵襲和浸潤進入子宮內膜，子宮內膜間質細胞轉化為蛻膜基質細胞(decidual stromal cell，DSC)的過程稱為蛻膜化過程。上述過程對于形成平衡的母胎界面至關重要，能指導滋養層細胞入侵內膜和胎盤生長，成功蛻膜化促進了氣體和營養物質的交換以及母體和胎兒之間的免疫調節。子宮內膜蛻膜化反應是妊娠成功的必要條件，為生長中的胚胎提供了生長因子和細胞因子，并可保護胚泡免受炎癥和活性氧類的影響。

滋養層細胞的入侵和胎盤的形成是良好妊娠必不可少的條件，而蛻膜化不足被認為是自然流產的重要原因。Su等[16]研究證實，胚胎黏附反應發生在妊娠第4天的傍晚，與妊娠第4天相比，小鼠妊娠第5天和第6天子宮內膜自噬相關標志物LC3和ATG5的表達相對降低，表明自噬對妊娠早期胚胎著床起關鍵作用，尤其是胚胎附著于子宮內膜后的蛻膜化過程。

蛻膜自然殺傷細胞異常與RSA的發生密切相關，蛻膜自然殺傷細胞比例占早孕期母胎界面免疫細胞的70%以上，主要在蛻膜化、子宮血管重構和誘導免疫耐受等階段發揮功能[17]。Lu等[18]的研究發現，與正常妊娠女性相比，URSA患者DSC的ATG5和LC3B表達水平降低，而自噬負相關蛋白泛素化蛋白質聚集體sequestosome 1水平較高，并提出蛻膜化過程自噬水平的增加是通過小眼畸形相關轉錄因子-腫瘤壞死因子受體超家族成員14-基質金屬蛋白酶9軸促進DSC表面黏附分子的表達，從而促進自然殺傷細胞在蛻膜、血管重構、胎兒和胎盤發育中的黏附和滯留。此外，URSA發生的可能機制為DSC自噬能力不足導致的蛻膜自然殺傷細胞黏附和滯留性降低。自噬是細胞質“重生”的過程，是細胞增殖、分化和死亡的關鍵。mTOR是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/mTOR信號通路中一種不可分割的激酶。自噬的調控機制分為依賴mTOR途徑和非依賴mTOR途徑兩類。既往研究表明，mTOR信號通路在早期胚胎發育和胚胎干細胞增殖中發揮重要作用[19]。Lu等[18]的動物研究發現，低劑量的雷帕霉素可促進自噬介導的自然殺傷細胞侵入自然流產模型小鼠DSC中，從而降低胚胎吸收率，避免流產的發生。

2.2自噬異常與RSA滋養細胞 滋養層細胞是胎盤組織的重要組成部分。滋養層細胞由細胞滋養層、合胞滋養層和中間滋養層3種細胞組成。在胎盤發育過程中，滋養層細胞的遷移和侵襲是胎盤血管生成的關鍵。有研究發現，自噬在滋養層細胞的增殖、分化、侵襲和血管重構中至關重要[20]。過度激活的自噬是程序性細胞死亡的一種非凋亡形式，自噬水平異常可能導致滋養層侵襲不足，是RSA發生的關鍵因素[21]。因此，自噬對胎盤和胎兒發育至關重要。國外相關研究發現，與正常妊娠者相比，RSA患者絨毛自噬活性水平明顯降低[17]。究其原因可能是通過靶向調節胰島素樣生長因子-2和遺傳印記基因PEG10，增加自然殺傷細胞的細胞毒性，抑制滋養細胞的侵襲能力，最終引發流產。另有研究顯示，與正常妊娠者相比，URSA患者的絨毛組織表現出高水平的自噬相關蛋白活性[22]。

Hh信號通路在人類滋養層細胞、妊娠維持和胎盤發育中起關鍵作用[23]。Shh和Dhh是Hh信號通路的配體。Pan等[24]分離了早孕期正常人工流產者和RSA患者的絨毛組織，采用免疫組織化學和蛋白免疫印跡法對標本進行檢測發現，RSA患者絨毛組織中Shh信號明顯受損，引起自噬激活和自噬泡積累，從而抑制滋養細胞運動，導致RSA患者異常胎盤血管消退，最終引發流產。

線粒體融合蛋白2是線粒體動態蛋白之一，通過調節呼吸鏈、線粒體膜電位，維持線粒體形態和功能的完整性[25]。研究發現，URSA患者絨毛組織中線粒體融合蛋白2表達水平低下，導致滋養層細胞的線粒體形態和功能明顯受損，滋養層細胞的生物學功能障礙，提示線粒體融合蛋白2的低表達與早期URSA患者胎盤絨毛組織中自噬異常激活有關[22]。YY1(Yin Yang 1)是一種調節細胞骨架相關蛋白表達的轉錄因子，相關研究證實，YY1可參與調節母胎界面的滋養層侵襲性，并可直接靶向作用于長鏈非編碼RNA漿細胞瘤變異體易位1(plasmacytoma variant translocation 1，PVT1)的啟動子區[26]。通過體外培養正常人工流產者和RSA患者原代絨毛組織發現，RSA組YY1和PVT1的表達明顯低于正常人工流產組，其可能機制是YY1-PVT1通過調節mTOR途徑介導的自噬影響滋養細胞的侵襲和黏附，YY1-PVT1-自噬軸可能參與維持正常妊娠，提示自噬參與RSA的發病機制[27]。因此，滋養層細胞自噬水平異常與RSA的發生有關，但自噬的增加或減少是否可能導致RSA仍有爭議，需進一步探索和研究。

2.3自噬異常與其他類型流產 自然流產是早期妊娠最常見的并發癥，發生率為17%～22%[28]。Avagliano等[29]發現，自然流產患者的絨毛標本中合胞體滋養層的自噬空泡濃度增加，且自噬表達較正常早孕組增強。

稽留流產又稱過期產，是一種特殊類型的流產。Beclin-1是調控自噬的關鍵因子，可調節自噬體的形成，p62主要參與自噬體的降解。謝冰[30]和苗繪[31]的研究均認為，稽留流產患者絨毛及蛻膜組織中Beclin-1表達高于正常早孕流產組，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也增強，而選擇性自噬受體p62表達水平低于正常早孕流產組，提示過度自噬可能誘導細胞凋亡，最終導致稽留流產的發生。低氧誘導的自噬主要通過介導缺氧誘導因子-1α/B細胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3信號通路實現，王銀芳[32]采用免疫組織化學和蛋白印跡法檢測正常早孕人工流產者和稽留流產患者絨毛組織缺氧誘導因子-1α、B細胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3、LC3蛋白的表達發現，稽留流產組缺氧誘導因子-1α及下游靶基因B細胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B 19000相互作用蛋白3的表達均低于正常早孕組，且稽留流產組絨毛組織LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平顯著下降，進一步行透射電鏡觀察發現，稽留流產組絨毛組織中自噬體減少，結構不典型。另有研究認為，RSA患者宮腔上皮和間質中缺氧誘導因子-1α的表達高于正常早孕組，表明子宮內膜缺氧和血管化狀態的改變可能是導致RSA的因素[33]。稽留流產與RSA的發生機制存在相似之處，目前稽留流產絨毛和蛻膜細胞自噬的關系仍存在一定爭議，但可明確病理性妊娠母胎界面的自噬水平均出現異常。

3 自噬與其他妊娠相關疾病

自噬可從胚胎、母體、母胎免疫界面三方面影響妊娠：①胚胎方面，包括影響受精和胚胎發育過程及滋養層細胞的功能；②母體方面，主要是干擾母體蛻膜化過程；③母胎免疫界面[34]。綜上，自噬水平的異常與多種妊娠并發癥有關，如先兆子癇、胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)和早產。自噬對妊娠的調節有望成為妊娠并發癥治療的新型靶點之一。

3.1自噬與早產 早產指妊娠滿28周至不足37周的分娩。自噬參與了早產的病理機制，可促進孕酮合成，進而抑制子宮收縮。有研究顯示，孕鼠胎盤中自噬受到抑制后，環加氧酶2和前列腺素F水平升高，導致蛻膜衰老并發生早產，故推測自噬誘導劑雷帕霉素可防止早產的發生，自噬激活可能預防非細菌感染引起的早產[35]。

過度的免疫炎癥反應是誘導早產發生的重要因素，ATG16L1是ATG5-ATG12復合自噬體形成的必要條件，ATG16L1基因敲除的巨噬細胞通過TIR結構域產生高水平的炎癥細胞因子。Hirota等[36]證實，子宮和胎盤中ATG表達降低。另有研究證實，早產患者胎膜中自噬相關蛋白Beclin-1以及ATG16L1的表達均低于足月女性，故認為炎癥介導早產的自噬水平較低[37]。

3.2自噬與先兆子癇 子癇是造成孕產婦死亡的重要原因之一，其中先兆子癇對孕婦和胎兒的影響極大，至今先兆子癇的發病機制仍不清楚。研究證實，先兆子癇患者胎盤組織中的自噬抑制標志物p62在絨毛外滋養細胞中呈高表達，提示在先兆子癇患者胎盤絨毛外滋養細胞中存在自噬抑制現象[38]。其可能機制是可溶性內皮素抑制了滋養細胞的侵襲，并且先兆子癇患者的血管重構功能的損傷受自噬水平抑制和轉化生長因子-β1信號轉導阻斷的影響。另有研究證實，與先兆子癇患者相比，正常妊娠婦女間質絨毛外滋養細胞中自噬抑制因子sequestosome 1無表達，而先兆子癇患者間質絨毛外滋養細胞中呈明顯高表達[39]。由此可見，先兆子癇患者間質絨毛外滋養細胞中的自噬激活功能受損，降低了間質絨毛外滋養細胞的侵襲能力，導致細胞內穩態受到破壞，細胞侵襲不足引起的胎盤缺血缺氧引發血管重構不足，導致先兆子癇發生。

3.3自噬與FGR FGR通常指妊娠37周后分娩胎兒的出生體重低于同胎齡胎兒出生體重均值的兩個標準差或低于同齡胎兒正常體重的10%，是圍生期的主要并發癥之一。目前，全球FGR發病率為5%～10%，此類患兒糖尿病、高血壓和心臟病的患病風險增加[40]。Zhang等[41]的研究顯示，FGR胎盤的Beclin-1和LC3BⅡ表達增強，自噬過度激活，滋養層內皮細胞和基質細胞的自噬空泡表達更豐富，推測過度激活的自噬可直接損害滋養層細胞，從而導致絨毛血管化減少，胎盤灌注不足，引起胎兒氧氣和營養缺乏。ATG9a為介導自噬體形成關鍵因子，Kojima等[42]的研究發現，敲除ATG9a純合基因小鼠的幼鼠體重明顯低于ATG9a雜合基因敲除幼鼠或野生型幼鼠。

4 小 結

自噬是一個多步驟、極其復雜的過程，在不同的狀態、部位、細胞、疾病過程中，具有不同的信號通路和生物學功能。目前自噬與RSA的研究已從動物模型擴展到人體活組織中，由于自噬過程是動態的，難以明確RSA樣本發生自噬反應的時間。自噬在RSA中的信號轉導通路和分子機制仍有待探討。目前有關自噬與RSA關系的研究逐漸增加，細胞自噬過度以及自噬不足均導致RSA患者胚胎不能正常黏附、侵襲和浸潤并進入子宮內膜，或導致滋養細胞的生物學功能障礙，進而破壞母胎界面的自噬功能平衡，引發RSA。由此可見，自噬調節可能為RSA等妊娠疾病的診療提供新的、有價值的研究思路和方向。