腹膜透析相關性腹膜炎動物模型的構建

王瑩瑩,沈瑞芬,梁耀軍

(蘭州大學第二醫院腎內科，蘭州 730030)

腹膜透析是終末期腎病的一種替代治療方法。腹膜炎是腹膜透析最嚴重的并發癥之一，是腹膜透析技術失敗最常見的原因[1-2]。急性腹膜炎的特點是腹膜炎癥細胞浸潤、內皮交換面積增加、小溶質和葡萄糖轉運增加、滲透梯度下降，最后導致超濾失敗，透析液蛋白丟失增加[3-4]。理想的動物腹膜透析模型能夠充分模擬人體腹膜透析過程，體現腹膜轉運的病理生理學特點、結構變化以及腹膜局部防御機制，為臨床前研究提供研究基礎。腹膜透析動物模型的造模方法有多種，不同研究選擇的實驗動物種類和品系、造模方法、造模試劑等也存在差異[5-8]。腹膜炎動物模型可分為急性腹膜炎模型和慢性腹膜炎模型。急性腹膜炎模型造模時間短，研究單次腹腔注射造模介質對腹膜的影響，主要用于研究水和溶質的滲透性以及透析液、干預劑、炎癥介質等的相互作用[9]。慢性腹膜炎模型的造模時間較長，是先給動物腹腔植入腹膜透析導管，通過導管灌注腹透液數天后再灌入造模試劑，主要用于評估長期腹膜透析后腹膜的變化，其過程更接近于人體腹膜透析過程。慢性腹膜炎模型可用于研究腹膜纖維化、包裹性腹膜硬化、反復發作的腹膜炎和腹膜形態學改變[10]。現從腹膜透析相關性腹膜炎動物模型的動物選擇、造模試劑及具體操作方法、模型評價、模型應用等方面進行綜述。

1 實驗動物的選擇

構建腹膜透析相關性腹膜炎模型的動物可分為大型動物(如家兔、狗、豬、羊、袋鼠)和小型動物(如大鼠、小鼠)，目前主要采用小型動物建模。每種動物模型都有其優點和缺點[3,6,11-14]。家兔的預期壽命長，腹膜透析導管植入更容易，但家兔較敏感，飼養和繁殖困難；鼠類易繁殖、費用低,但壽命較短、體積小,并發癥發生風險高[12]。在腹膜透析相關性腹膜炎動物模型的構建中大鼠和小鼠使用最廣泛，大鼠模型和小鼠模型造模方法、模型結果相似，主要區別是建立模型所需的時間和所使用的透析液或藥物的劑量不同，大鼠模型的優點是可以獲得更多的樣本，特別是血液、腹透液和尿液樣本。小鼠建模獲得的樣本量少，但由于轉基因小鼠的應用，小鼠模型在機制研究方面具有優勢[3,13-14]。如需了解腹膜透析對殘余腎功能的影響，腹膜透析動物模型必須與腎功能不全模型結合使用，腎功能不全模型常采用5/6腎切除術，也可以采用雙腎切除模型[3]。但在5/6腎切除和腹膜透析雙重應激下模型動物存活率較低，如僅為了闡明腹膜透析過程中腹膜的變化，只需要建立腎功能正常的動物模型。腹膜透析相關性腹膜炎動物模型多采用腎功能正常模型。

2 造模試劑及劑量

細菌性腹膜炎是腹膜透析技術失敗的主要原因，最常用的造模試劑為革蘭陰性菌(常見為大腸埃希菌)及其來源的脂多糖，此外表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等也是引起腹膜透析相關性腹膜炎的常見細菌。此外，也可采用其他微生物(如酵母菌)致真菌性腹膜炎。

2.1脂多糖和革蘭陰性菌 腹膜透析相關性腹膜炎動物模型造模選用最多的造模試劑為脂多糖，脂多糖主要來源于革蘭陰性菌[14-16]。最常見的革蘭陰性菌是大腸埃希菌，而脂多糖是大多數革蘭陰性菌的細胞壁成分，也是炎癥強有力的誘發劑，反復向動物腹腔內注射大腸埃希菌可導致腹膜持續炎癥[15-17]。脂多糖大多來自大腸埃希菌，血清型為0111∶B4，造模方法是腹腔內單次注射脂多糖。在大鼠模型中，脂多糖的單次注射劑量為1 mg/kg；在小鼠模型中，脂多糖的單次注射劑量為10 mg/kg[15,17-18]。文獻報道，單次給予脂多糖劑量為2 mg/kg時會致全部大鼠死亡，給予1 mg/kg時可致不同比例的大鼠死亡，給予<0.1 mg/kg劑量的脂多糖全部大鼠存活[19]。單次腹腔注射脂多糖，急性腹膜炎常發生在48 h內[17]。與脂多糖模型相比，大腸埃希菌暴露模型可誘導更強的白細胞浸潤，透析液中白細胞數量顯著增加，但兩種模型中水通道蛋白1的表達均未發生變化[5]。小鼠模型可用采用109/ml菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)的大腸埃希菌稀釋于2 ml透析液中進行造模[5,19]，或用2×107CFU，每周注射1次，共注射4次造模[16,19]。另外，通常在進行動物實驗前應進行預實驗以確定最終的注射劑量。

2.2革蘭陽性菌 革蘭陽性菌，特別是凝固酶陰性葡萄球菌，是腹膜透析相關性腹膜炎的常見致病菌[1-2]。表皮葡萄球菌是最常見的凝固酶陰性葡萄球菌，給予每只小鼠熱殺傷表皮葡萄球菌5×108CFU，每周注射1次，共注射4次，小鼠可以存活49 d[14,20]。另有文獻報道，給予每只小鼠腹腔注射表皮葡萄球菌5×108CFU的劑量不致命，急性感染發生在注射后24～36 h[16]。另一種方法是模擬與器械相關的腹膜炎，將擬植入的腹膜透析導管在表皮葡萄球菌1457中培養120 h，誘導導管生物膜形成，再將導管植入動物體內，每24小時沖洗1次導管進行造模[17]。

金黃色葡萄球菌是導致腹膜透析相關性腹膜炎的常見細菌，感染后表現為腹腔導管出口部位及隧道炎癥、腹膜炎及腹腔膿腫。向C57BL/6 J和BALB/c小鼠腹腔注射金黃色葡萄球菌2×108CFU可導致0～25%的小鼠在15 d內死亡，接種量增加到(5～7)×108CFU，50%～70%的小鼠在24 h死亡，劑量繼續增加至1×109CFU可導致90%的小鼠在12 h內死亡，尸檢和組織病理學檢查均顯示接種點腹腔膿腫[12]。van Westrhenen等[21]分別給予大鼠含1×104、1×106、1×108CFU的金黃色葡萄球菌ATCC 25923懸液0.5 ml單次腹腔注射，結果發現,這3種劑量的細菌菌落都會導致大鼠發生非致命性腹膜炎，高劑量組大鼠存活率低于劑量組。

2.3其他微生物 真菌性腹膜炎是一種嚴重的并發癥，致死率高，預后較差。酵母菌常用于腹膜透析相關性真菌性腹膜炎造模。真菌性腹膜炎多采用腹膜刮擦法進行造模，造模關腹時腹腔注射含有酵母菌懸浮液的高糖腹膜透析液5 mg/2 ml，關腹后繼續給予酵母菌懸浮液直接注射，關腹后即刻5 mg/5 ml，關腹后2～4 d每日再給予10 mg/10 ml酵母菌懸浮液，共注射5 d，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌懸浮液在整個腹腔內擴散[22-23]。Mizuno和Ito[22]比較了不同劑量酵母菌造模的差異發現，腹腔壁厚度和炎癥細胞數量與酵母菌劑量相關。

3 腹膜透析相關性腹膜炎造模操作

腹膜透析相關性腹膜炎造模法可概括為3種：腹腔直接注射造模試劑法、通過腹膜透析導管造模法以及腹膜刮擦法。

3.1腹腔直接注射造模試劑法 在麻醉或不麻醉動物的情況下消毒動物下腹壁，用注射器和針頭直接向腹腔注射造模試劑或含有一定量造模試劑的透析液，皮膚穿刺僅限于腹部下象限，注射時左右下象限交替使用，注射過程中注意避免穿通腸管。重復注射會增加腹腔內出血和感染的可能，影響實驗結果[8,24]。腹腔直接注射造模試劑法的優點是操作簡便，建立模型需要時間短，是目前研究中最常選用的方法，該方法的缺點是易引起腸穿孔和透析液滲漏。

3.2通過腹膜透析導管造模法 動物麻醉狀態下，在動物腹壁正中做一個小切口，然后將一根特殊的導管通過皮下隧道插入動物頸部或背部，將導管的另一端植入腹腔，最后縫合腹膜和腹壁[3,6,9-10]。每日通過導管給動物注射肝素配比的氯化鈉或等滲氯化鈉，防止導管阻塞。導管多為硅膠材質，直徑和長度可以根據動物體型定制。通過腹膜透析導管給藥的優點是能模擬腹膜炎的病理生理過程，可用于觀察長期腹膜透析后腹膜的形態學變化，多用于研究反復發作性腹膜炎及導管定植菌相關性腹膜炎[6]。該方法的缺點是手術操作難度較大，飼養時感染風險較高，死亡率較高，導管的額外費用高[3]。同時腹腔導管植入增加了腹膜壁層白細胞滾動和外滲、腹膜纖維化和血管化風險[25]。腹膜炎過程中易發生導管堵塞和透析液滲漏[6,9]，通過導管給予肝素后又會對實驗結果產生影響[8]。

3.3腹膜刮擦法 動物麻醉狀態下，用15 ml的無菌聚丙烯管頂端以2次/s的頻率機械刮擦動物右側腹膜壁層60 s，刮擦方向每隔5 s轉換1次(如由垂直方向改為水平方向或反之)，刮擦動物腹膜表面時，用鉗子緊緊捏住打開的腹膜邊緣，防止刮擦過程中腹膜移動。如果在實驗結束時需測量腹膜功能，必須同時刮擦腹膜左右兩側[24,26]。切口縫合后通過腹腔注射酵母菌懸浮液，每次注射后均需按摩腹部，使酵母菌在整個腹腔內擴散，刮擦后1～7 d觀察腹膜炎征象。腹膜刮擦法常用于真菌性腹膜炎造模，該方法的缺點是刮擦過程需要較高的技術[3,23]。

4 腹膜組織的處理及觀察

4.1腹膜標本取樣和處理 與腹膜透析患者不同，動物模型極少應用引流裝置。膜透析相關性腹膜炎動物模型造模成功的診斷不能基于透析液細胞數量的增加，診斷的金標準是腹膜組織存在廣泛的炎癥細胞浸潤[21]。腹膜組織非常脆弱，暴露在空氣中會迅速干燥，易損傷,在處理模型動物時必須謹慎。剪腹壁時，動作要輕柔避免用力拉伸，在模型動物上腹部左上象限或腹部中線附近的左下象限或置管位置對側的橫切面收集壁腹膜[11]。壁腹膜覆蓋在腹壁肌肉組織上，需與腹壁肌肉組織一同取下固定，注意避開穿刺部位。剪下腸系膜及網膜，留取臟腹膜。真菌性腹膜炎取腹膜標本前應仔細檢查腹壁刮擦部位，確定取材部位[22]。收集壁腹膜和臟腹膜，標本用10%緩沖甲醛固定，石蠟包埋，薄切片；臟腹膜可用液氮冷凍[6,17,23]。

4.2腹膜病理學表現 腹膜炎的特征是腹膜白細胞浸潤，病理切片上表現為腹膜厚度增加、明顯水腫、大量單核細胞浸潤，腹膜血管增生伴擴張[5,15,18]。組織切片可用蘇木精-伊紅染色和Masson染色，蘇木精-伊紅染色可觀察腹膜炎癥細胞浸潤情況及腹膜厚度，Masson染色下測量腹膜厚度，在每個切片上隨機取5～6個位置測量腹膜厚度，取其平均值。小天狼星紅染色可用于觀察膠原蛋白，采用內皮細胞標志物CD31標記后,沿腹膜橫切面全長進行腹膜血管計數，記為腹膜血管數/mm。亦可用免疫印跡、免疫組織化學、免疫熒光等觀察腹膜組織[5]。

5 腹膜平衡實驗

腹膜平衡實驗是監測腹膜透析過程中溶質和液體轉運情況的重要方法，用于評價腹膜功能。腹膜平衡實驗需要在短時間內收集腹膜透析液，常采用腹腔注射或向腹腔植入腹膜透析導管的方法注入透析液[3]。關于腹膜透析動物模型腹膜平衡實驗的腹腔灌入量存在爭議，通常大鼠腹膜透析模型的腹腔灌注量為10～30 ml，小鼠為1.5～2.5 ml[26]。大量灌注腹透液會引起模型動物疼痛和腹腔滲漏[3,18]。對于大鼠腹膜透析模型：通常向腹腔內注入25 ml含4.25%葡萄糖的常規腹膜透析液，保留4 h后收集腹腔內透析液，記錄標本容積并測量尿素氮、肌酐、葡萄糖的水平，腹膜超濾量通過計算灌入前后腹透液差值獲得，同時需通過尾靜脈、頸內動脈或心臟穿刺留取動物血液標本。在小鼠模型中，接受2 h腹膜透析液交換，使用4.25%或7%的葡萄糖透析液2 ml進行腹膜平衡實驗[18]。腹透液標本收集可以通過導管留取或將動物處死后打開腹腔收集殘存的腹透液。為了便于收集腹腔內所有液體，打開腹膜腔時用巴斯德吸管收集透析液或使用稱重法預先稱重一塊紗布，可通過計算紗布被腹腔液體浸泡前后的重量變化計算吸收的液體量[9,18]。

6 腹膜透析相關性腹膜炎動物模型的應用

腹膜透析相關性腹膜炎動物模型主要應用于：①腹膜透析相關性腹膜炎發生機制、腹膜結構及功能變化的研究，如水和溶質在腹膜中的轉運、腹膜炎癥過程中信號轉導以及細胞因子、趨化因子和補體的作用等[15,17,20,27-30]。②觀察某些新型阻斷炎癥因子的化合物在腹膜炎中的抗炎、抗氧化活性及可能的毒性作用，為后期治療急性腹膜透析相關性腹膜炎提供依據[5,8,17]。

7 小 結

腹膜透析相關性腹膜炎仍是導致腹膜透析患者技術失敗的主要原因之一,是終止腹膜透析轉至血液透析的主要原因。研究腹膜透析相關性腹膜炎的一個重要步驟是建立可以模擬臨床情況并可復制的動物模型，而腹膜炎動物模型的建立是實驗基礎研究中不可或缺的部分。腹膜透析相關性腹膜炎動物模型的構建過程要結合不同的研究設計方案、目的，選擇不同的造模動物，合適的干預試劑及造模操作方法。腹膜炎模型建立過程中除了要注意實驗動物操作過程中需普遍注意的事項外，還要掌握腹膜取樣及保存方法，腹膜平衡實驗實施過程的細節問題。目前腹膜炎動物模型相關研究中大多采用急性模型，但在反復發作性腹膜炎及導管定植相關的腹膜炎研究中仍需采用慢性模型。慢性腎衰竭模型并發癥多，模型動物死亡率高，在腹膜透析相關性腹膜炎的動物模型中大多數采用腎功能正常的模型，不能完全模擬終末期患者腹膜透析的過程。因此，在未來腹膜透析相關的臨床前研究中，仍需要積極探索更好的模擬終末期腎病人體腹膜透析過程的動物模型。